蔬果汁及葡萄酒中甲醇生成减量.DOC

蔬果汁及葡萄酒中甲醇生成、減量及其細胞毒性之研究 A study on the formation and reduction, cytotoxicity of methanol in fruit and vegetable juices and grape wine 研究生：侯智耀 Hou, Chih-Yao 指導教授：陳裕鏞 Chen, Yu-Yawn 王裕泰 Wang, Yuh-Tai 江啟銘 Jiang, Chii-Ming 吳明昌 Wu, Ming-Chang 【摘要】 本論文分成三個部分來探討蔬果中甲醇之生成、降低方法與毒性，第一部分探討蔬果中甲醇之生成，第二部分探討酚酸類降低葡萄酒甲醇含量之可行性，第三部分探討甲醇之細胞毒性。 第一部分：蔬果中甲醇生成之探討 首先將15 種市售蔬果之鮮榨蔬果汁，在不同存放溫度與時間條件下，果膠酵素對蔬果汁中甲醇生成之影響。結果顯示蔬果榨汁後隨存放時間增加，甲醇的生成亦有逐漸增加之趨勢，其中以鮮榨的蕃茄汁(10.92±0.91 mg/100 mL) 與貯藏後的蕃茄汁(30℃下貯藏3 小時為24.08±1.57 mg/100 mL；4℃下貯藏3 小時為19.13±3. 將鮮榨蔬果汁分別儲存於4℃和30℃下180 分鐘後分析其理化特性，並將數值進行多元回歸分析，結果顯示：在果汁中甲醇的釋放與PE 活性和PAL活性呈現正相關而與總果膠含量呈現負相關；在蔬菜汁中甲醇的釋放則與以PE活性、pH值和可滴定酸呈現正相關，與 此外HMCL-AIS果膠親和性膠體分離之晚崙西亞橙(VPE1)為一耐酸型之PE，在pH 3~3.5 仍具有16~30%的活性，因此添加到葡萄酒釀造模式系統中(pH 約為3~3.5)，經過15天發酵後，導致甲醇含量由22.4±7.4 ppm增加至89.4±2.4 ppm (VPE1-1X)或168.0±5.8 ppm (VPE1-3X)。由於大部分水果果汁之pH介於3～5，顯示此類耐酸型PE的活性愈高，對於果汁中甲醇含量的影響愈大。 第二部分：酚酸類降低葡萄酒甲醇含量之可行性研究 在葡萄酒釀造模式系統之實驗發現，添加香豆酸(coumaric acid) 或没食子酸(gallic acid) 到商業果膠酵素溶液中，可以降低甲醇的生成；感官品評結果顯示：添加香豆酸組之酒液整體接受度為最佳，其次為没食子酸組。為了解酚酸類物質對於商業果膠酵素中PE 的動力學表現，本文以酚酸類混合商業果膠酵素或HMCL-AIS 管柱分離純化之PE，探討其酵素動力學反應，結果發現香豆酸與没食子酸對商業果膠酵素中PE 及經過分離純化之PE 酵素之抑制反應，均為混合型非競爭性抑制(mixed type noncompetitive inhibition) 。 第三部分：甲醇細胞毒性之探討 首先分析Clone 9 正常老鼠肝細胞株、Hep G2-C3A人類肝癌細胞株以及ARPE-19人類視網膜正常細胞株對於甲醇之毒性反應，經過24hrs反應，Clone 9、Hep G2-C3A 和ARPE-19 的LD50 分別為700 mM、3,500mM 和1,500 mM。 以倒立顯微鏡觀察細胞型態的變化發現，當甲醇濃度超過1,000 mM時細胞數量有減少的現象；當濃度達3,000 mM時細胞明顯減少，且有死亡懸浮的狀況產生，甚至有呈空泡的現象，但在0~10,000 mM濃度下皆未觀察到凋亡小體。 在0~10,000 mM甲醇濃度下，隨甲醇濃度提高，細胞內ATP含量有下降的趨勢，然而LDH release 則有增加之現象。以流式細胞儀分析發現：甲醇並不會導致細胞產生明顯的sub G1峰，亦不會對細胞DNA的含量造成影響。以蛋白質體學分析甲醇對細胞之影響發現，甲醇會引起Hep G2-C3A 和ARPE-19細胞蛋白質點含量變化，然因濃度效應，因此後續探討甲醇細胞毒性之研究，建議甲醇代謝產物之細胞毒性，並分析鑑定蛋白質點，以瞭解甲醇攝取後對體內細胞之毒殺影響。 關鍵字：蔬果汁、葡萄酒、甲醇、果膠酯酶、細胞毒性 【Abstract】 The present paper divides into three parts to discuss the production, reduction and toxicity of methanol in fruits and vegetables. In Part one, the production of methanol in fruits and vegetables were investigated. In Part two, the feasibility of using phenolic acids