Western_blot_实验介绍及流程.pdfVIP

Western blot 实验介绍 及流程 Bio-rad垂直电泳、电转装置 • 目的与要求 掌握垂直电泳、电转的基本原理与操作步骤 • 培训内容 熟悉western-blot 与SDS的基本原理与实验流程 • 考核题目 Bio-rad垂直电泳、电转装置 • 电泳槽 玻璃板、梳子、加样校准架等 • 电转移槽 切胶板、黑白夹板、海绵垫等 • 电泳仪 用途：用于生物学实验中对特定目的蛋白质的分离，定 性及定量的检测分析，是Western-blot （蛋白免疫印 迹）实验中非常重要的部分。 Western blot 实验原理 • Western blot是利用已知的特异性抗体与抗原 （即组织 细胞中的目的蛋白 ）能特异性结合的原理 ，通过化学反 应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂 （如酶、金 属离子、同位素 ）显示一定的颜色或发光来对组织细胞 内目的蛋白定性及半定量的研究。 抗原 生物素标记 ECL发光试剂 的二抗 一抗 Western blot 检测蛋白表达实验流程 SDS-聚丙烯 提取总蛋白 蛋白浓度测定 酰胺凝胶电泳 一抗 封闭 转膜 洗涤 二抗 洗涤 分析 扫描 ECL检测 SDS电泳的基本原理 SDS电泳技术首先在1967年由Shapiro建立,1969年 由Weber和Osborn进一步完善。 SDS-聚丙烯酰胺（PAGE ）凝胶电泳，是在PAGE凝胶中 引进SDS （十二烷基磺酸钠，含有大量带负电荷的SO32- ）， SDS能破坏蛋白质分子的二级、三级结构，在含有强还原 剂的溶液中可与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物 （电泳样品 加入样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟）。由于结合大 量带负电荷的SDS ，好比蛋白质穿上带负电的 “外衣” ， 蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了，从而起到消除各蛋白 质分子之间自身的电荷差异的作用，蛋白质在SDS 胶中的迁移率主要取决于其分子量的大小。 Western blot 实验流程 1 A protein sample is subjected to electrophoresis on an SDS- polyacrylamide gel. SDS电泳操作步骤 （1 ）配制分离胶 注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速灌胶 （2 ）灌分离胶 灌胶之上轻轻加一层水或正丁醇液 （3 ）配制浓缩胶 注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速用滴管灌胶 （4 ）灌浓缩胶 倒掉分离胶上的水或正丁醇之后，倒置吸净残留溶液，灌注浓缩胶，将梳子插好,胶凝固