米曲霉来源α－半乳糖苷酶基因galA在毕赤酵母中的-动物营养学报.PDF

动物营养学报２０１８，３０（１１）：４５６９⁃４５７９ ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ 　 ｄｏｉ：１０．３９６９／ ｊ．ｉｓｓｎ．１００６⁃２６７ｘ．２０１８．１１．０３３ － 米曲霉来源α 半乳糖苷酶基因ｇａｌＡ 在毕赤酵母中的 表达及其对豆浆中大豆寡糖的酶解效果 郭昱含　 杨勇智　 郭贺楠　 王　 剑　 曹云鹤∗ （中国农业大学动物科学技术学院，动物营养学国家重点实验室，北京 １００１９３） － 摘　 要： 本试验旨在研究米曲霉来源α 半乳糖苷酶基因ｇａｌＡ 在毕赤酵母中的表达及其对豆 － 浆中大豆寡糖的酶解效果。 以ＮＣＢＩ数据库中米曲霉来源α 半乳糖苷酶基因ｇａｌＡ 的ｍＲＮＡ 序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＸＰ＿００１８１７３１１．１）为依据，利用ＰＣＲ 扩增得到ｇａｌＡ 基因并根据毕赤酵 母使用密码子的偏好性优化基因序列，构建野生型和优化型毕赤酵母工程菌株，摇瓶发酵１２０ ｈ， 测定酶学性质。 设置２５和４５ ℃ ２ 个温度，每个温度下各设置０．６、１．２和２．４ Ｕ ３ 个加酶量，用 － － 发酵得到的α 半乳糖苷酶酶解１０ ｍＬ 豆浆中的大豆寡糖。 结果显示：该 α 半乳糖苷酶基因 － ｇａｌＡ 全长１６０５ｂｐ，不含内含子，编码５３４ 个氨基酸，诱导１２０ ｈ后优化型工程菌株的α 半乳糖 － 苷酶活性为１．９５２ Ｕ／ ｍＬ，比野生型工程菌株提高了２８５％。 发酵得到的α 半乳糖苷酶的最适 ｐＨ 为４．３３，最适温度为５５ ℃；在ｐＨ３．００～８．００ 间稳定性良好，在５５ ℃条件下保持４０ ｍｉｎ后残 － 余α 半乳糖苷酶相对活性为６０％；该酶对大部分金属离子具有抗性，但其被ＭｎＳＯ 抑制；以对 ４ － － － 硝基苯基 β Ｄ 吡喃半乳糖苷（ｐＮＰＧ）为底物时的酶动力学参数米氏常数 （Ｋ ）为 ｍ －７ × ０．０２４ ３ ｍｏｌ／ Ｌ，最大反应速度（Ｖ ）为１．０ １０ ｍｏｌ／ （Ｌ ·ｓ）。 酶解试验结果显示，４５ ℃下加酶 ｍａｘ 量为２．４ Ｕ反应１２ｈ后，大豆寡糖中棉籽糖的降解率为５０．０％，水苏糖的降解率为３１．９％。 由此 － 可见，本试验中生产的α 半乳糖苷酶对豆浆中的大豆寡糖有一定的降解作用。 － 关键词： 米曲霉；α 半乳糖苷酶；密码子优化；毕赤酵母；大豆寡糖 中图分类号：Ｑ７８６　 　 　 　 文献标识码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１００６⁃２６７Ｘ（２０１８）１１⁃４５６９⁃１１ 　 　 大豆、大豆产品及大豆加工副产品是人及动 糖苷酶酶解是消除大豆寡糖抗营养因子的常用方