基于蛋白组学技术松属素对柑橘青霉的抑菌机理研究-农产品加工与贮藏保鲜专业论文.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文3．2．2试剂 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 3．2．2试剂 30 3．2．3实验步骤 ．30 3．3结果与分析 35 3．3．1 MRM实验方法的建立 35 3．3．2 MRM鉴定蛋白结果 36 3．3．3 qPCR实验结果 37 3．4讨论 42 第四章松属素与靶酶结合能力的预测及诱发死亡机制的探讨 ．44 第一节呼吸链酶蛋白同源建模与分子对接 ．44 4．1引言 ．44 4．2材料与方法 ．．44 4．2．1材料收集 ．．44 4．2．2试验方法 ．44 4．3结果与分析 ．45 4．3．1同源模建 。45 4．3．2分子对接 。46 4．4讨论 ．52 第二节染色法判断松属素诱导的程序性死亡 ．53 4．1引言 ．53 4．2材料与方法 ．53 4．3结果与分析 ．54 4．4讨论 ．57 参考文献 58 致谢 ．66 万方数据 基于蛋白组学技术的松属素对柑橘青霉抑菌机理研究摘要 基于蛋白组学技术的松属素对柑橘青霉抑菌机理研究 摘要 黄酮化合物具有多样的生理活性和潜在的药用价值，其中C5．OH和C7．OH是重 要的抗菌活性基团，研究表明，松属素能显著抑制意大利青霉呼吸作用并诱发细胞 程序性死亡，已有呼吸抑制试验证明线粒体呼吸电子传递链酶复合物I，IV和V活 性会直接被松属素抑制；松属素抑制青霉的关键部位，可能处于线粒体呼吸链上， 进而导致细胞能量代谢障碍，诱发细胞凋亡或程序性坏死。本文以柑橘青霉病的主 要病原菌意大利青霉为指示菌，使用被证明抗菌活性最强的5，7二羟基黄酮类化合 物松属素，借助蛋白组学IRAQ技术，来研究松属素不同时间处理后，引起的意大 利青霉蛋白表达差异，以及通过分子模拟作为参考，呼吸链复合物作为靶点的可能 机制，及松属素引起程序性死亡的探究。 主要研究结果如下： 1．松属素处理后，意大利青霉的氧化磷酸化通路、TCA循环产生多种1．2倍以 上表达差异的蛋白，其中线粒体呼吸链酶复合物I，Ⅳ和V，及呼吸相关酶琥珀酸 脱氢酶和苹果酸脱氢酶产生显著差异，导致导致菌体能量代谢紊乱；程序性死亡过 程中某些指示蛋白，比如Apoptosis-inducing factor、凋亡BAX inhibitor蛋白、肽酰 脯氨基顺反异构化的酶(CⅥ)A)等表达产生显著变化；另外，应激状态下诱导表达 的伴侣蛋白HSP70，其在维持蛋白质构象上具有多种作用，经过松属素处理后，产 生了1．4倍以上的异常表达。 2．通过计算机辅助设计软件MOE，对呼吸链蛋白同源建模，然后通过与松属素 分子对接实验，探究酶复合物与松属素对接的可能性，以此作为呼吸链酶复合物作 为靶蛋白的佐证。经过同源建模与分子对接后，我们发现具有与松属素结合的可能 性蛋白全部集中在线粒体呼吸链蛋白复合物I和蛋白复合物V，其中得分最高的 Unigene2720_CK_OA属于复合物V，松属素与受体Unigene2720_CK一0A结合腔形 成多个氢键相互作用，A环5位羟基和结合腔88位Tyr残基形成氢键：C环羰基与 82位Ala残基形成氢键；除此之外，参与配体相互作用的残基还包括78位Glu、77 位Glu、73位Pro、75位Ser、74位Lys、79位Ala、81位Leu、80位Asn、96位 Glu、95Val、97位GLy、98位Gin、25位Val等。 3．利用MRM技术对目标蛋白的进行特异性选择，验证差异蛋白的表达变化， 结果显示，我们鉴定出的复合物I、II、IV、V中的多个肽段，在表达趋势上与原ITRAQ 结果一致，在表达量的差异上表现更为显著；采用qPCR验证目标蛋白是否在转录 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文水平存在差异，结果表明复合物I、II、IV、V在mRNA的表达水平与蛋白最终表 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 水平存在差异，结果表明复合物I、II、IV、V在mRNA的表达水平与蛋白最终表 达情况上并不一致，仅有Unigene2707 CK 0A、Unigenel4205 CK 0A(复合物V) 是在mRNA表达差异与蛋白表达差异上完全一致。 4．使用Z．VAD．FMK和Necrostatin．1结合依文思蓝染色判断细胞程序性死亡方 式，其中Z．VAD．FMK是一种pan．caspase抑制剂(泛硫胱胺酸蛋白酶抑制剂)， Necrostatin．1是RIPl特异性的抑制剂，结果显示通过抑制pan．caspase，没有产生抑 制青霉细胞死亡的作用，而使用RIPl抑制剂，我们减少了松属素诱导的青霉菌死亡， 可以推测松属素诱导了细胞程序性坏死(Necroptosis)，在药物处理前期这种不需要依 赖caspase的死亡方式占主导地位。 关键词：