聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦测定蛋白质等电点.PDF

聚丙烯酰胺凝胶等电聚 焦测定蛋白质等电点 一、实验目的 • 学习等电聚焦的原理 • 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦 电泳技术 二、实验原理 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing，简称IEF)：通过蛋白质等 电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。（分辨 率：0.001pH单位） 以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物。 两性电解质载体 (carrier ampholyte) 在电场作 用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的线 性pH梯度。 蛋白质在pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于 pI处时，不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。— —pI、分离、鉴定 等电点（isoelectric point ）:在某一pH时，蛋白质的 净电荷为零。 蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象 两性电解质载体 易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳 定的pH梯度。 pI处有良好的电导系数——保持均匀的电场。 分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与 生物大分子分开。 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无 变性作用，其化学组成不同于蛋白质。 多羧基、多氨基脂肪族化合物异构物/同系物之混 合物 + – pH 3 pH 7.5 pH 10 + – pH 3 pH 7.5 pH 10 + – pH 3 pH 7.5 pH 10 + – pH 3 pH 7.5 pH 10 IEF分离蛋白质并测定pI 胶长mm 测定pH梯度的主要方法 胶条切段、水浸、精密试纸测定 表面pH微电极直接测定 一套已知pI蛋白作标准 胶条-70℃冰冻，1mm切片，0.5ml 0.01mol/L KCl, 微电极测pH 圆盘电泳装置 双向电泳 ——蛋白质组学研究的重 要技术 双向凝胶电泳two-dimensional electrophoresis IEF——SDS相结合的电泳技术 三、实验操作 装管（封底） 制胶（7.5ml ）： 14%凝胶贮液 2.5ml H O 4.6ml 2 Ampholyte （40% ）pH3-10 0.38ml 10%Ap 0.