酶活性浓度测定的主要影响因素及控制.PPT

酶活性浓度测定的主要影响因素及控制 广州医学院医学检验系 临床生化教研室 酶（enzyme） 酶的应用 临床诊断酶学产生至今已有100年的历史。 用于诊断的酶类已超过100多种，常用的数十种。 酶测定约占目前临床化学总工作量的1/4到1/2。 酶的概念 是一种由活细胞产生，具有高度专一性、高度催化活性的特殊蛋白质，又称为生物催化剂。 酶的测定方法分为绝对定量法和相对定量法两大类，以后者为主。 酶催化化学反应的能力称为酶活性（activity）。 酶活性浓度的测定受许多因素的影响。 酶活性浓度测定的主要影响因素 1. 标本及标本采集和处理因素 2. 试剂及方法学因素 3. 仪器因素的影响 4. 测定条件与参数设置 1.标本及标本采集和处理因素的影响及控制 1.标本及采集和处理的影响因素 1.1 溶血 1.2 抗凝剂 1.3 温度 1.4 空气与光线 1.5 标本副反应 1.6 酶蛋白浓度 1.7 其他 1.1 溶血 最重要的影响是RBC内酶的大量释出。 大部分酶在细胞内外浓度差异明显，且其活性远高于血清； 如RBC内的LD、AST和ALT活性分别较血清中高100、15和7倍左右。 RBC释放的Hb在300～500nm可见光波段能使吸光度值明显升高，干扰分光光度计的测定。 1.1 Hb的吸光度曲线 1.1 溶血影响的控制 减少溶血 体外溶血可通过实施样品制备技术的标准化加以克服； 分清体内溶血与体外溶血。 减少溶血的干扰 可通过设置样品对照，或使用双波长比色、连续监测法以及改进商品试剂等措施，克服对分光光度分析的影响。 应用血清(溶血)指数直接判断溶血程度。 1.1 注意: RBC中酶的干扰 不仅表现在溶血影响上，采血后如不及时将血清和血凝块分离，血细胞中酶同样可以透过细胞膜进入血清， 所以，静脉采血后，必须在1～2h内及时离心，将血清与血细胞、血凝块分离，以免引起误差。 1.2 抗凝剂 临床上除非测定与凝血或纤溶有关的酶，一般都应以血清作为首选测定标本。 大多数抗凝剂都在一定程度上影响酶活性， EDTA、草酸盐和柠檬酸盐等抗凝剂，它们为金属离子螯合剂； 在去除Ca2+同时也去除其中Mg2+、Mn2+等离子，Ca2+是AMY的激活剂，Mg2+是ALP、CK和5′-核苷酸酶（5′-NA）的激活剂。 1.2 肝素 是一种粘多糖， 是对酶活性影响最小的抗凝剂， 对ALT、AST、CK、LD和ACP无影响， 适于急诊时迅速分离血浆进行测定。 1.3 温度 由于血清清蛋白对酶蛋白有稳定作用，如无细菌污染，某些酶（如AST、?-GT和ALP等）可在室温保存1～3天活性不受影响。 有些酶极不稳定，如血清前列腺ACP，在37℃放置1h，活性可下降50%。 1.3 贮存不同室温体液酶的稳定性（活性变化小于10%） 1.3 温度影响的控制 及时检测 低温贮存 大部分酶在低温中比较稳定，因此当天不能测定时，应在血清分离后置冰箱中冷藏。 1.4 空气与光线 血清置于空气中时， 血中CO2丧失极快，pH可在15min内由7.4增至8.0，从而使对碱性环境敏感的ACP活性迅速下降。 某些酶易受光线破坏， CK可因吸收蓝光而引起酶发生不可逆地失活，其失活程度与暴光时间的长短成正比。 1.5 副反应 副反应是指酶促反应体系中，除待测酶反应外，其他非待测酶和物质引起的干扰待测酶测定的反应。 NAD（P）H是目前使用最多的指示反应物质。 体内存在数以百计的氧化还原酶，它们的辅酶很多是一致的。 若存在内源性代谢物，必然会相互干扰。 1.5 副反应(酶偶联法测ALT) 由于反应体系中含有大量NADH和LD，可与血液标本中所含丙酮酸反应，引起340nm波长处吸光度下降，从而引起ALT活性测定误差。 ALT活性测定的反应式如下： 1.5 副反应的控制 可通过加入副反应抑制剂， 或对样品进行预处理等方法给予排除。 双试剂底物启动模式因不增加成本、不耗费时间是最经济的方法。 1.6 酶蛋白浓度 酶蛋白在低浓度时易失活，可能是亚基易解离、易吸附于容器上和易发生表面变性之故。 酶蛋白在高浓度时较稳定，但活性过高超过检测仪器的线性范围时，需将样品进行稀释或减少样品用量后再行测定。 样品稀释后所测得的活性常偏高，可能与抑制剂被稀释有关。 1.7 其他 样本器皿的质地和洁净度，采血部位，以及血清中过量的胆红素、脂质，样品制备过程中的振摇等，均可引起酶活性改变。 季节 冬季气温低，血液凝固慢，血清分离时间延长，可引起血细胞内酶释至血清，加上血清与空气长时间接触，可使某些抑制剂遭到破坏，故冬季测定LD的活性较夏季高。 2. 试剂及方法学因素的影响及控制 2. 试剂及方法学的影响因素 酶的测定大多使用商品试剂盒 不同厂家酶试剂盒的测定原理、试剂配方（包括缓冲液、底物、添加剂等