基于化痰法探讨皂荚提取物对肝癌大鼠microRNA表达的影响-中医内科学专业论文.docx

I I 中文摘要 目的：本课题前期研究发现中药化痰药皂荚具有明显抗肝癌的作用，皂 荚 提 取 物 能 够 明 显 调 控 肝 癌 细 胞 TGF- β /Smads 信 号 系 统 以 及 PTEN/PI3K/AKT 信号通路。我们推测皂荚提取物可能通过调节其相关 microRNAs 表达来调控相关信号分子，从而发挥抗肝癌的作用。在前期 研究的基础上，我们通过理论和实验研究，选择与之相关的 microRNAs 及靶基因进行验证。进一步阐明该药治疗肝癌的分子机制，为中药皂荚 开发及临床应用提供科学依据。 方法： 第一部分 理论研究 1. 中医药防治肝癌的历史悠久，在肝癌的病情进展中痰瘀互结贯穿 于疾病始终，化痰法是治疗肝癌的重要治法，也应贯彻肝癌治疗的始 终。 2. 说明中药化痰药皂荚的价值、特点及古今临床应用。并阐述皂荚 提取物具有抗肝癌作用的前期研究依据。 3. 随着分子生物学对肝癌的研究进展，肝癌分子靶向治疗是当今临 床研究最为活跃的领域之一，在中医药理论指导下，结合现代分子生物 学技术，阐明中医药防治肝癌的机制，是中医药对肝癌防治的发展方 向，也有助于发现肝癌治疗的新靶点。 第二部分 实验研究 1. Walker-256 移植性肝癌大鼠模型的建立 取出储存 Walker-256 癌细胞株的冻存管，立即放进 37℃水浴槽 中，等待完全融化过后，再将其取出，并于无菌的环境下进行细胞悬液 吹打，然后转移细胞悬液到 15ml 离心管中。稍微晃动离心管，逐渐加 入 PBS 缓冲液到 8ml 为止。然后以 每分钟 1000 转的速度离心离心管 10min，去除上清液，用 PBS 缓冲液冲洗 2 次。然后以 4ml PBS 缓 冲液进行细胞重悬，将细胞悬液收入 5ml 注射器，再将其注入 5 只 II II Wistar 大鼠腹腔，每只注入 1ml。每天观察大鼠腹部膨隆情况，20 天后 形成癌性腹水。 将上述 Wistar 大鼠腹腔内的红色洗肉水样癌性腹水用注射器抽出 15ml，放入离心机内以每分钟 2000 转的速度离心 2min, 离心后去除上 层清液体, 保留下层粘稠的浓缩液体，用 PBS 缓冲液冲洗 3 次,制备细胞 悬液备用，密度为 2 x107/ml。 将 65 只约 200g 左右的 SD 大鼠按体重平均分为 6 组，即空白 组、模型组、皂荚提取物高剂量组，皂荚提取物中剂量组，皂荚提取物 低剂量组及索拉非尼组，每组 10 只。另外 5 只作为验证造模而备用。 实验手术前大鼠禁食 12 小时，将模型组、皂荚提取物高剂量组，皂荚提 取物中剂量组，皂荚提取物低剂量组及索拉非尼组分别按 40μg/100g 体重水合氯醛腹腔内麻醉，将大鼠以仰卧位固定在鼠板上，然后以 0.5% 活力碘腹部消毒，用手术剪沿腹白线剪开腹部皮肤，接着逐层分离，使 大鼠腹腔暴露，即可以看到肝脏膨出。选择最外层的肝叶，用注射器抽 取 1ml 癌性腹水细胞悬液，以 45 度将注射器斜刺入所选肝叶内，深度约 0.5cm，0.15ml 细胞悬液缓缓推送注射器注入制备的癌性腹水，立即拔出 注射器针头，用消毒棉签按压穿刺点一直到不出血为止，将肝脏还纳入 腹腔内，常规缝合关闭腹腔，红霉素软膏擦拭消毒伤口。 为证实造模成功，所有 53 只大鼠造模完毕后，在造模后第 7 天，在 其中随机挑选 3 只，另外 12 只正常大鼠中挑选 2 只，取出大鼠肝脏，观 察病理切片。 2. 处理措施 根据人临床用量（皂荚生药量 1.5g.70kg.d-1），给药剂量根据参考 文献，人与大鼠体表面积折算的等效剂量计算为实验灌胃剂量（折算系 数如下表，人体平均体重标准为 70kg，大鼠平均体重标准为 200g），按 1 ： 2 ： 4 设 置 皂 荚 提 取 物 低 剂 量 组 (128.57mg.kg.d-1) 、 中 剂 量 组 (257.14mg.kg.d-1) 和高剂量组 (514.28mg.kg.d-1);索拉非尼:68.57mg/kg/d （索拉非尼成人 0.8g/d,按人与小鼠体表面积折算的等效剂量计算）；空白 PAGE PAGE VI 组给予 0.9%生理盐水 10 ml/kg/d；模型组：建立肝癌模型后，给药同空 白组；各组灌胃给药量均为相同体积；移植后 1 周后开始治疗；各组连 用 28d。终止治疗时间为移植后 35d。 将需取材大鼠行颈推脱臼处死, 在无菌条件下，消毒后进行开腹， 空白组选取大鼠组织结构完整的部分做肝脏标本；经过造模的大鼠，选 取肝脏内癌组织，如有肝癌结节者，尽量取最大的部分；将取出组织用 滤纸吸干后留存，将待检测组织分组处理，切成范围为 1cm×1cm，厚 0.2cm 的组织块，连续切片，用甲醛乙醇混合液对其进行固定 3 小时