艰难梭菌毒素受体结合区的免疫效应研究-微生物学专业论文.docxVIP

安徽医 安徽医科大学硕士学位论文 PAGE PAGE 2 PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 Ig Immunoglobulin 免疫球蛋白 WB western blotting 蛋白质印迹 DAB diaminobenzidine 二氨基联苯胺 TEMED tetramethy ethylene diamine 四甲基乙二胺 SA streptavidin 链霉亲和素 MLD minimum 100% lethal dose 最小 100%致死剂量 TcdA toxin A receptor-binding domain 毒素 A 受体结合区 TcdB toxin B receptor-binding domain 毒素 B 受体结合区 PMC pseudomembranous colitis 伪膜性肠炎 pI isoelectric point 等电点 PaLoc pathogenicity locus 病原性位点 MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)- 噻唑蓝 2,5-diphenyltetrazolium bromide CD50 50% cytotoxicity concentration 半数细胞中毒剂量 ED50 Maximum titer of 50% neutralizing 50%中和最大滴度 艰难梭菌毒素受体结合区的免疫效应研究 摘 要 艰难梭菌（Clostridium difficile，C. difficile）是 25%以上抗生素相关性腹泻 （Antibiotic-associated diarrhea，AAD）的病因。自 1978 年首次发现该菌与伪膜性 肠炎（pseudomembranous colitis，PMC）有关以后引起重视。2003 年起核糖体 027 型（简称 RT027）新菌株在多个国家暴发流行，造成大量死亡案例。中国也报道 了散发病例。RT027 因发生变异，传染性和耐药性增强，造成的死亡率、发病率 也高于以往。很多国家包括中国将艰难梭菌作为法定传染病必报的监测病原。疫 苗被认为是控制 CDI（C.difficile infection）最根本有效的措施。 艰难梭菌最主要的毒力因子是毒素 A 和毒素 B，抑制毒素的作用就能够有效 防止感染造成的严重损伤，起到免疫防御的效果。毒素 A 和毒素 B 的 C-端都由多 个重复序列构成，是毒素识别和结合细胞受体的功能区，称为受体结合区 （receptor-binding domain，RBD），重复序列的多少直接影响毒素与细胞表面受体 的结合力强弱。 艰难梭菌共有 24 个毒素型（toxinotype），150 个核糖型，毒素的变异广泛存 在。为最大程度覆盖保护性抗原表位，提供最大限度保护，本文针对标准产毒型 菌株（toxinotype 0）ATCC 43255 毒素 A 和 B 的全长 RBD 设计了候选抗原，进行 了重组制备（命名为 TcdA 和 TcdB），考察单一或组合免疫后在小鼠中的免疫原性 以及对标准株和 RT027 代表株 ATCC BAA 1870 毒素的保护效应。 HYPERLINK \l _bookmark0 第一部分 艰难梭菌天然毒素的提取、纯化与鉴定 为验证 ATCC 43255 和 ATCC BAA 1870 的毒素差异，对两株菌毒素 A 和毒素 B 的编码基因进行测序分析，表明 ATCC BAA 1870 菌的毒素 A 和毒素 B 基因与 Genbank 公布的两株 027 型菌（R20291，CD196）同源性均为 100%。ATCC BAA 1870 与 ATCC 43255 的毒素 A 氨基酸同源性 98.15%，与毒素 B 氨基酸同源性 92.18%， 两种毒素最保守的是酶活区，受体结合区变异最大。 为获得 ATCC 43255 和 ATCC BAA1870 的天然毒素 A 和毒素 B，首先用硫酸 铵盐析法将培养菌液中的毒素沉淀和浓缩，获得 ATCC 43255 粗毒素 80mg/L，ATCC BAA1870 粗毒素 86.5mg/L。用抗毒素 A 和抗毒素 B 鼠单抗经 Western blot 鉴定能 被特异抗毒素抗体识别，毒素相对分子量与文献报道一致。以 ATCC 43255 和 ATCC BAA1870 粗毒素腹腔注射 BALB/C 小鼠的 MLD 分别为 360ng 和 540ng，对 Vero 细胞的 CD50 分别为 70pg，90pg，与文献报道接近。为获得纯化和精制的毒素 A 和毒素 B，将鉴定正确的粗毒素进行 DEAE Sepharose 离子交换层析，最终分离得 到电泳单一条带的毒素 A 和毒素 B，经