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0PN
放化疗敏感性的研究
专 业 外科学
硕士研究生 杨莉
导 师 左文述研究员
中 文摘要
【目的】本研究拟构建针对OPN的质粒表达载体，转导高转移性乳腺癌细胞
系MDA．MB．23
乳腺癌细胞生长、增殖和转移等生物学行为的影响，并从OPN基因沉默对肿瘤
细胞乏氧程度、HIF．1和VEGF表达的影响等各个方面探讨OPN基因沉默对乳
腺癌放化疗敏感性的影响。
Bank下载OPN
【方法】1．构建靶向OPN的RNAi干扰质粒：从GenemRNA基因序
列，利用相应软件设计RNAi用单链寡核苷酸。按照试剂盒说明书构建转导质粒，互
1和MDA。MB．468细胞，经
细胞转染和稳定细胞株的筛选分别转导MDA．MB．23
Blasticidin
10～14d筛选，直至对照组未转导细胞中无存活细胞，而转导细胞株中存
活的即为OPN基因沉默细胞。对OPN基因沉默细胞进行扩大培养。3乏氧处理：将
O．5％02，24
转染组和对照组细胞放入乏氧箱内，乏氧条件为：37℃5％C02 h后提
取蛋白。4照射处理：转染细胞和对照细胞按照射剂量梯度逐步稀释，接种于6孔板。
接种个数分别为200、400、1000、2000。照射条件为：6
00cm，照射剂量分别为：0、2、4、
加速器，PHILIP)，照射野为20×20cm，源皮距1
6 RT-PCR
Gy。2,-．-,3周后做克隆分析。5转导细胞体外生物学特性检测：Real-time
的表达。划痕试验、MTT法及细胞衰老实验比较亲本细胞与OPN基因沉默细胞的集
落形成能力和增殖能力差异。Transwell体外侵袭实验比较细胞侵袭转移潜能。流式
细胞仪检测细胞周期和凋亡的差异。克隆形成试验比较转导细胞与亲本细胞的放射
敏感性差异；MTT法比较转导细胞与亲本细胞对化疗药物(阿霉素)敏感性的差异。
【结果】成功构建乳腺癌细胞OPNRNA干扰质粒，经转染筛选获得乳腺癌
II
OPN
mRNA和蛋白质的表达量均显著下调；细胞周期S
染细胞株MDA．MB．343
1．1
期比率MDA．MB．23 0％、22．77％和
1、MDA．MB．neg和MDA—MB一343分别为2
43．67％，S期出现明显阻滞；凋亡率转染组由3．61％提高到4．91％；细胞衰老实验
结果显示OPN基因沉默组细胞衰老进程加剧；MTT法细胞增殖活性明显下降：
24h的A值分别为O．361
O．7428士0．041
胞的A值相比差异均有显著性(方差分析，24h F值
细胞组和阴性对照组相比统计学具有显著性差异(p0．01)。表明靶@OPN基因沉
默表达后乳腺癌细胞的增殖分裂能力明显下调。乏氧处理后对照组OPN的表达增
加，OPN基因沉默组受到抑制。放射处理对OPN基因沉默蛋白质表达的影响无统
计学意义。OPN基因沉默组经乏氧处理后与放化疗抗拒相关的HIF一1和VEGF的表
达量显著下调。细胞凋亡率转染组由3．61％提高到4．91％，2Gy照射后对照组和
47．64
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