节律基因mPeriod2抑制肿瘤细胞生长的体内外研究-生物医学工程专业论文.docx

四Jfl丈学博士论文节律基因mPeriod2抑制肿瘤细胞生长的体内外研究 四Jfl丈学博士论文 节律基因mPeriod2抑制肿瘤细胞生长的体内外研究 生物医学工程专业 研究生：华慧 指导教师：王正荣教授 肿瘤是威胁人类健康的重大疾病之一，发病率居lO种重大疾病的第二位。 虽然肿瘤的诊治取得了很多进展，但对肿瘤患者的长期疗效仍然亟待提高。动物 实验和对人体肿瘤的研究均表明生物节律参与肿瘤的发生、发展。本项目立足 于研究近日节律核心基因mPeriod2(mPer2)和肿瘤的关系。探讨节律基因mPer2 在肿瘤细胞内过表达或低表达对肿瘤细胞生长和凋亡的影响，并深入研究其机 制，进而寻求治疗肿瘤的新方向。 尸B力作为近日节律钟控系统的一个必不可少的组成部分，不仅调节近日节 律．同时还影响器官功能。我们首先研究了Per2在肿瘤细胞中高表达是否影响 癌细胞生长或凋亡．本研究采用脂质体介导法，将roPer2真核表达质粒 pcDNA3．1(+)-mPer2和空质粒pcDNA3．1(+)转染Xd,鼠Lewis肺癌细胞株(Lewis lung carcinomacell，LLC)、小鼠乳腺癌细胞株(mousemammarycarcinomacell， EMT6)和NIH 3T3细胞，采用MTT法、光镜下细胞计数绘制细胞生长曲线、 细胞平板集落形成实验等方法研究mPer2过表达对小鼠肿瘤细胞LLC和EMT6 细胞增殖的作用。利用流式细胞术、基因组DNA片断分析、Hoeehst33342染色 和电子显微镜观察细胞形态等方法研究mPer2过表达对小鼠肿瘤细胞LLC、 EMT6细胞和NIH 3T3细胞凋亡的作用。本研究证实过表达roPer2能明显抑制 小鼠Lewis肺癌细胞株和小鼠乳腺癌细胞株的生长增殖，并能明显诱导以上肿 瘤细胞凋亡，但对正常细胞却无诱导凋亡作用。细胞周期检测发现roPer2过表 达引起小鼠肿瘤细胞LLC、EMT6细胞Gl期阻滞。roPer2过表达后，肿瘤细胞 的细胞核DNA降解。呈现典型的DNA Ladder区带特征，Hoechst33342染色发 现凋亡细胞明显增多。电子显微镜观察到mPer2过表达导致肿瘤细胞形态发生 变化，细胞核染色质凝集，呈明显碎块状致密浓染。 四川大学博士论文此外，为了解下调内源性mPer2基因表达对肿瘤细胞凋亡的影响，我们首 四川大学博士论文 此外，为了解下调内源性mPer2基因表达对肿瘤细胞凋亡的影响，我们首 先用lOOnM TPA处理LLC细胞以诱导内源性mPer2基因表达，其中一组仅用 TPA处理，一组同时用TPA和随机反义寡核苷酸，另一组用TPA和mPer2反 义寡核苷酸处理。处理后24小时，将细胞在血清饥饿条件下继续培养48小时， 然后收集细胞，固定，行流式细胞分析，检测以上三组细胞凋亡情况。另用 RT-PCR检测mPer2基因表达情况．与仅用TPA处理组和TPA联合随机反义寡 核苷酸处理组相比，mPer2反义寡核苷酸处理抑制了TPA诱导的mPer2基因表 达。流式细胞分折表明抑制内源性mPer2基因表达可显著降低血清饥饿所诱导 的细胞凋亡．这些结果从另一个侧面证实了mPer2基因促进细胞凋亡． 为了进一步探讨节律基因mPer2过表达抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞 凋亡的机制，本研究采用RT-PCR、蛋白印迹和流式细胞术等方法研究mPer2过 表达对小鼠Lewis肺癌细胞株(LLC)凋亡相关基因如p53，c-Myc、Bcl-2，BcI-XL 和Bax等基因mRNA和蛋白表达的影响。RT-PCR结果显示mPer2过表达对LLC 细胞c-Myc，Bcl-2和Bcl-XL基因的mRNA表达具明显的抑制作用，同时可增强 p53和Bax基因的mRNA表达．蛋白印迹和流式细胞术检测都显示mPer2过表 达可明显降低LLC细胞c-Myc、Bcl-2和BcI．)(L的蛋白表达水平，同时明显增 强p53和Bax的蛋白表达水平．这些结果表明PER2的促凋亡作用是因为其增 强了促凋亡的信号传导和削弱了抑制凋亡的基因。 除了以上体外试验外，我们也观察了PER2对Lewis肺癌在小鼠体内生长 的影响．采用小鼠Lewis肺癌细胞株(UC)于C57BL／6小鼠右前肢腋窝皮下接 种，建立C57BL／6小鼠移植瘤模型。小鼠以12小时光照，12小时黑暗交替 (LDl2／12)提供光源照制2周。随机分组，雌雄各半．采用pcDNA3．1(+)与体内 转染试剂混合物、pcDNA3．1(+)．mPer2与体内转染试剂混合物在移植瘤内多点 注射．10天后收集标本，采用流式细胞术检测各组移植瘤细胞的周期及凋亡率， 免疫组化法分析PCNA蛋白表达．结果显示。pcDNA3．1(+)．mPer2组瘤重明显 低于pcDNA3．1(+)对照组，抑瘤