5 DNA序列分析.ppt

第五章 DNA序列分析 DNA 的序列分析有两种基本方法， Maxam-Gilbert 化学降解法和 Sanger 酶学法。因为测序每个反应读取的序列是有限的，做长片段 DNA 或基因组测序时，需要选用一定的策略。测序的策略有 primer walking ，随机测序，定向测序等。现在全自动测序仍然沿用 Sanger酶学法，但是在标记上作了改进。 DNA 测序结果通过生物信息学分析，获取需要的信息。 5.1 Maxam-Gilbert 化学降解法 1977年， A.M. Maxam 和 W. Gilbert 首先建立了 DNA 片段序列的测定方法，其原理为：将一个 DNA 片段的 5’端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰特定碱基，然后用哌啶进行特异裂解，从而产生一系列长度不一而 5 端被标记的 DNA 片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的 DNA 的碱基序列。 化学降解测序法的基本步骤 硫酸二甲酯[（CH3O）2SO2]是一种碱性化学试剂，可以使 DNA 链上的腺嘌呤 A 的 N2 和鸟嘌呤 G 的 N７ 甲基化，但是鸟嘌呤 G 的 N７ 甲基化速度比腺嘌呤 A 的 N2 甲基化速度要快 4-10 倍，并且在中性 pH 环境中， DMS 主要作用于鸟嘌呤 G ，使之甲基化，导致糖苷键断裂。 哌啶甲酸可以使 DNA 链上的嘌呤在酸的作用下发生糖苷水解，导致 DNA 链在脱嘌呤位点（G和A）发生断裂。 肼，又称联氨 NH2.NH2 ，在碱性环境中作用于胞嘧啶 C 和胸腺嘧啶 T 的 C4 和 C6 位置，导致糖苷键断裂。如果加入高浓度的盐（1.2M NaOH），肼则主要作用于胞嘧啶 C ，使之断裂。 化学修饰剂 断裂碱基 化学修饰试剂 化学反应 G dimethyl sulphate（硫酸二甲酯） 甲基化 A+G Piperidine formate（哌啶 甲酸）, pH2.0 脱嘌呤 C+T hydrazine（肼，联氨NH2.NH2） 打开嘧啶环 C hydrazine + NaCl（1.5M） 打开胞嘧啶环 AC 90?C, NaOH（1.2M） 断裂反应 哌啶（90 ?C, 1M) 在修饰位点前端使DNA 的磷酸脂键发生裂解 Maxam-Gilbert化学降解法测序的常用化学试剂 AC G T+C C 化学降解测序法的应用 Maxam-Gilbert 化学降解测序法不需要进行酶催化反应，因此不会产生由于酶催化反应而带来的误差。 化学降解测序法特别适用于测定含有如 5-甲基腺嘌呤 A 或者 G + C 含量较高的 DNA 片段，以及短链的寡核苷酸片段的序列。 Maxam-Gilbert 化学降解测序法的测序长度大约为250个碱基。 5.2 Sanger双脱氧链终止法 双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的 3 位置的 -OH 缺失。当它与其他正常核苷酸混合在同一个扩增反应体系中时，在 DNA 多聚酶的作用下，虽然它也能够象正常核苷酸一样参与 DNA 合成，以其 5 位置的磷酸基，与上位脱氧核苷酸的 3 位置的 -OH 结合，但是，由于它自身 3 位置 -OH 的缺失，至使下位核苷酸的 5 磷酸基无法与之结合。 P OH O H NTP P OH H dNTP P H H ddNTP 反应体系加dNTP时，DNA链能正常延伸(extented) OH 反应体系加ddNTP时，DNA链不能正常延伸(extented) H 序列分析的基本步骤 模板制备 单链、双链DNA均可，但必须保证足够的浓度和纯度。 引物设计 长度为18-22个碱基；Tm值约为55-60℃；避免Hairpin和Dimer。 反应步骤 模板变性 退火 标记 延伸 电泳和数据读取 3’AGCTCGTAGCATGCATCGATGCATGCTAGCAT 5’ Template ddATP dATP, dCTP, dGTP, dTTP GA*GCA* ddCTP ddGTP ddTTP TCGTA TCGTACGTA TC TCGTAC TCG TCGTACG T TCGTACGT 3’AGCTCGTAGCATGCATCGATGCATGCTAGCAT 5’ dA*TP, dCTP, dGTP, dTTP 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；放射自显影 A: dNTP + ddATP G: dNTP + ddGTP C: dNTP + ddCTP T: dNTP + ddTTP ACGT ACCAAAGACCCAGGATCGCCA 序列分析的工作模式 手动测序 按照上述经典的测序方法进行，在PCR技术广泛应用之前是DNA测序的主导方法。 PCR测序 手动