金葡萄万古霉素耐药株膜蛋白质组学的研究-内科学专业论文.docxVIP

摘要目的： 摘要 目的： 金黄色葡萄球菌(金葡菌)(Staphylococcus auFeus，口ureuS) 是引起社区感染和医院感染的主要病原菌之一。随着广谱抗生素及 免疫抑制剂等的广泛应用，＆aureus抗生素的耐药现象日益严重， 己遍布引起医学界极大关注。目前＆aureus对万古霉素的耐药机制 尚未清楚。本文建立及优化细菌膜蛋白的提取方法，同时通过应用 蛋白质组学技术对金葡菌万古霉素耐药株(vancomycin．resistant Saureus，VRSA)和敏感株(Methicillin-resistant S．aureus，MRSA) 膜蛋白质组之间的差异进行研究分析，鉴定差异点蛋白质，为研究 膜蛋白与S．aureus对万古霉素耐药之间的关系，具有重要的现实意 义。 方法： 1．细菌膜蛋白提取方法的建立及优化 将MRSA接种于M-H肉汤培养基，离心收集菌体。利用一步法及 三步法提取MRSA膜蛋白质，分别用Bradford法测定相应样品蛋白 质浓度，并行2一DE和图像分析。 2．金葡菌万古霉素耐药株膜蛋白质的研究 (1)临床MRSA为我院检验科标本，共收集16株。按照NCCLS 标准，应用琼脂平板稀释法及MRSA特异性基因mecA的扩增鉴定 MRSA，诱导产生5株万古霉素耐药株。此外师妹代洪还赠送3株 VRSA。 (2)提取膜蛋白质 ①经SDS—PAGE分析OMP的成分，凝胶分光光度扫描仪测定膜蛋 白的相对含量。 ②以pH3～10预制胶条等电聚焦为第一向，等电聚焦结束后在平 衡液中平衡30分钟后，再以SDS为第二向进行2-DE，再分离蛋 白质，脱胶，固定，敏化银染，显影，ImageScanner扫描，ImageMaster 2D E1 ite3．01软件分析凝胶蛋白质图谱，比较VRSA和敏感株膜蛋白 质凝胶图谱，分析差异表达的蛋白质。同时建立一个能正确区分VRSA 和MRSA的膜蛋白质组模式，应用VRSA膜蛋白质组模式在双盲法条 件下检测3张VRSA和16张MRSA膜蛋白质凝胶图谱。3．质谱分析 件下检测3张VRSA和16张MRSA膜蛋白质凝胶图谱。 3．质谱分析 (1)MALDI—TOF肽质量指纹图谱 (2)蛋白质数据库搜索 结果： 1．利用一步法及三步法提取MRSA膜蛋白质，并用Bradford法测 定三步法样品蛋白质浓度为629．25±5．60 u g／m1，一步法为 215．00±6．90 u g／ml。同时应用ImageScanner扫描2-DE图谱， ImageMaster 2D E1 ite 3．01软件对一步法及三步法提取MRSA膜蛋白 质2一DE图谱进行分析。发现三步法提取MRSA膜蛋白质图谱平均每张蛋 白斑点数为980±15．7个，一步法为706±11．4个。 2． (1)MRSA和金葡菌ATCC25923膜蛋白质图谱与VRSA相比，发 现凝胶上分子量为45KD、43KD、30KD、20KD、14KD的条带较VRSA 清晰，分子量为45KD和14KD的膜蛋白的相对含量较VRSA多。 (2)MRSA膜蛋白质图谱平均每张蛋白斑点数为920±20．8个， VRSA为760-4-26．6个，大部分蛋白质点主要分布在分子量为 30KI)～97KD，等电点用4~9的区域。当某一蛋白质点在某一类型组织 凝胶中表达较其他类型组织凝胶明显增强(校正后蛋白质点的表达 量相差3倍以上)，并在不少于50％的该类组织凝胶图谱中表达，视 其为差异蛋白质点。MRSA VS VRSA，在MRSA膜蛋白质凝胶图谱中发 现13个差异蛋白质点，在VRSA膜蛋白质凝胶图谱中发现差异蛋白 质点15个。 (3)发现一个由6个蛋白质点组成的VRSA膜蛋白质2一DE图谱 模式。16张MRSA膜蛋白质2一DE图谱中，全部得到正确诊断，3张 VRSA膜蛋白质2一DE图谱，有3张得到正确诊断，灵敏度为100％， 特异性为i00％。 3．差异蛋白质点的鉴定 (1)选取上述差异蛋白质点进行MS分析，获得18张PMF，初 步鉴定了其中的9张PMF。其中PyrR双功能蛋白 (PyrR bifunctional protein)、蛋白SAV0289(protein SAV0289)、 Orf保守蛋白(Orf conserved protein)、IS605／IS200转座酶 (IS605／IS200—1ike transposase)等4个蛋白质点在VRSA 2-DE 凝胶图谱中表达明显增高。多谷氨酸合成蛋白(Poly—gamma-glutamate 凝胶图谱中表达明显增高。多谷氨酸合成蛋白 (Poly—gamma-glutamate synthesiS protein，PgsA)、蛋白MWl201 (protein MWl201)、表面蛋白C(surfac