金属硫蛋白MT基因的质粒构建和在细胞中的过表达分析-遗传学专业论文.docxVIP

安徽医 安徽医科大学硕士学位论文 PAGE PAGE 1 第一部分 金属硫蛋白 MT 基因的质粒构建和在细胞中 的过表达分析 中文摘要 目的 为研究 MT 基因的生物学功能，构建带 FLAG 标签的真核表达载体，将 MT2A 质粒瞬时转染至 COS7 细胞，观察表达的蛋白在细胞内的定位；将 MT2A 与 CLIC1 质粒共同瞬时转染至 COS7 细胞，观察两种蛋白在细胞内的共定位情况； 将质粒分别转染至 HEK 293T 细胞，用免疫共沉淀实验检测 MT2A 蛋白与 CLIC1 蛋白在哺乳动物细胞内的相互作用情况。构建 pGEX-3X-MT2A 原核表达载体，将 质粒转化至 BL21 菌株中，IPTG 诱导 GST-MT2A 的表达，进行 GST pull-down 实 验检测 MT2A 蛋白与 CLIC1 蛋白在体外的相互作用。 方法 用 PCR 方法，以含人 MT 全长 cDNA 序列的质粒为模板，扩增 MT 全长 序列，酶切回收目的片段，插入到载体 pGADT7、pCDNA3.1 上，构建酵母表达载 体 pGADT7-MT，真核表达载体 pCDNA3.1-MT-His6、pCDNA3.1-MT-FLAG。以 同样方法构建原核表达载体 pGEX-3X-MT。重组质粒经酶切鉴定正确的送测序公 司测序。 分别将 pCDNA3.1-MT2A-FLAG 质粒瞬时转染至 COS7 细胞，在荧光显微镜 下观察 MT2A 蛋白的细胞定位；pCDNA3.1-MT2A-FLAG 与 pCDGFP-CLIC1 共同 转染至 COS7 细胞，荧光显微镜下观察两种蛋白在细胞内的共定位；将两组质粒 共同瞬时转染至 HEK 293T 细胞，通过免疫共沉淀实验检测 MT2A 蛋白与 CLIC1 蛋白在哺乳动物细胞内的相互作用。构建表达载体 pGEX-3X-MT2A，转化大肠杆 菌 BL21，表达融合蛋白 GST-MT2A，进行 GST pull-down 实验，检测 MT2A 蛋白 与 CLIC1 蛋白在体外的相互作用。 结果 酶切和测序图谱证明各载体均构建正确。在荧光显微镜下观察到，在 COS7 细胞中，MT2A 蛋白主要分布在细胞质中。共定位实验观察到 MT2A 蛋白与 CLIC1 蛋白无明显共定位。免疫共沉淀实验表明，在 HEK 293T 细胞中，MT2A 蛋白与 CLIC1 蛋白在细胞内不存在相互作用。GST pull-down 实验表明 MT2A 蛋白和 CLIC1 蛋白在体外无相互结合。 结论 在 COS7 细胞中，MT2A 蛋白与 CLIC1 蛋白无明显共定位；免疫共沉淀实 验证明在 HEK 293T 细胞中，MT2A 与 CLIC1 蛋白不存在相互作用；GST pull-down 实验表明 MT2A 蛋白和 CLIC1 蛋白在体外无相互结合。 关键词 MT2A/ 质粒构建/ GST pull-down / 免疫共沉淀/ 蛋白质相互作用 The Plasmid Construction of Metallothionein Genes and Analysis of Overexpression in Cells Abstract Objective To investigate the biological functions of MT genes, we constructed eukaryotic expression vectors, tagged with FLAG. The plasmid was transiently transfected into mammalian cells to observe the localization of expressed protein. The plasmid of MT2A was transiently cotransfected with CLIC1 into mammalian cells to define whether two expressed proteins were colocalized. The plasmid of MT2A and CLIC1 were transiently cotransfected into mammalian cells to perform co-immunoprecipitation assay. To express fusion protein GST-MT2A,GST pull-down assay was performed to detect the interaction between MT2A and CLIC1 in vitro. Methods PCR method was used t