金黄色葡萄球菌毒力分型及其毒素致乳腺上皮细胞凋亡的分析-食品科学专业论文.docxVIP

山东师范大学硕士学位论文 山东师范大学硕士学位论文 山东师范大学硕士学位论文 山东师范大学硕士学位论文 ii ii I I 6 生化检测与基因检测结果汇总20 7 分析与讨论21 HYPERLINK \l _TOC_250002 hla 与 hlb 21 HYPERLINK \l _TOC_250001 mec-a 与 qac-a 22 HYPERLINK \l _TOC_250000 pvl 23 7.4 coa（凝固酶）基因检测 24 7.5 nuc（耐热核酸酶）基因检测 24 本章小结25 第三章 重组 α-溶血素致乳腺细胞凋亡的研究 26 1 试验材料26 1.1 试验动物26 1.2 菌种和质粒26 1.3 主要试剂26 1.4 主要试剂的配制27 1.5 主要仪器27 2 实验方法28 2.1 α-HL 目的蛋白和 pET-32a(+)空载体的诱导表达和纯化 28 2.2 目的蛋白的定量检测28 2.3 小鼠乳腺细胞培养及重组 α 溶血素互作 29 3 结果与分析30 3.1 重组 α-溶血素的基因表达与 SDS鉴定 30 3.2 细胞培养形态与鉴定30 3.3 蛋白标准曲线的制作与目的蛋白含量测定31 3.4 乳腺细胞液中细胞因子的变化32 3.5 数据统计与分析33 3.6 结果33 3.7 对乳腺上皮细胞中 TNF-?、IL-2 和 IL-6 水平的影响 36 第四章 结论37 参考文献38 致 谢42 攻读学位期间发表的学术论著43 金黄色葡萄球菌毒力分型及其毒素致乳腺上皮细胞凋亡的研究 中 文 摘 要 本实验对山东及周边牛场做了乳房炎的检测，采集并分离了129株金黄色葡 萄球菌，并对金黄色葡萄球菌毒力因子设计设计相关引物，通过分子PCR的方法， 对耐热核酸酶、凝固酶、耐消毒剂基因、杀白细胞素基因、耐甲氧西林基因、α -溶血素及β -溶血素基因做一个分布调查，对它们的做一个基因分型。以重组α -溶血素对小鼠乳腺上皮细胞进行攻击，对细胞因子IL2、IL6、TNF-α 进行检测， 探讨重组α -溶血素对小鼠乳腺细胞的损伤及凋亡的影响。希望对本实验室所分 离金葡菌做一系统的鉴定和分型，构建金葡菌种质资源库，得到金葡菌分子流行 病学资料，为奶牛金葡菌引起的乳腺炎的防治提供新思路。 1. 牛源性金葡菌各种毒力因子基因型的检测 设计耐热核酸酶、凝固酶、耐消毒剂基因、杀白细胞素基因、耐甲氧西林基 因、α -溶血素及β -溶血素引物，进行 PCR 检测。表型分型 56 株表现为α 溶血， 检出率为 43.4%；43 株表现为β 溶血，检出率为 34.11%；另有 29 株表现为不溶 血，检出率为 22.48%；其中 hla 基因检出率 34.88%，hlb 基因检出率为 42.60%。 发现 46 株 Pvl 基因阳性株，检出率为 35.66%；其中 coa 生化检测(试管法)，可 使兔血清凝固的有 50 株，生化方法检出率为 38.76%，coa 基因检测阳性株有 39 株，基因检出率为 30.23%，其中生化与基因检测能对应的有 14 株，对应符合率 为 10.85%；在对 nuc（耐热核酸酶）的检测中，甲苯胺蓝生化检测有 106 株阳性， 生化检出率为 82.17%，基因检测有 31 株阳性，基因的检出率为 24.03%，其中生 化与基因检测能对应的有 28 株，对应率为 21.71%；在对 mec-a 基因的检测中， 共发现有 25 株阳性株，基因的检出率为 19.38%；在对 qac-a 基因的检测中，发 现有 13 株阳性菌株，基因的检出率为 10.08%。 在溶血表型中，α 溶血要多于β 溶血；hlb 基因的检出率比 hla 基因的检出 率要高。金黄色葡萄球菌所检出溶血素基因与血琼脂平板出现的溶血现象并非一 一对应关系。发现 46 株 Pvl 基因阳性株，检出率为 35.66%，较人医上的检测率 没有较大的差异，说明大多数金葡菌都是含有杀白细胞素。其中 50 株可使兔血 清凝固，检出率为 38.76%，凝固酶基因检测阳性株有 39 株，基因检出率为 PAGE PAGE IV III III 30.23%，证明凝固酶基因是普遍存在的，与各种文献报道一致。对金葡菌致病性 菌株的重要指标之一 nuc（耐热核酸酶）的基因检测中有 31 株阳性，基因的检 出率为 24.03%，说明此基因检测可以作为对致病性金葡菌检测的一个方法补充。 Mec-a 的检出，说明在我们山东周边牛场已经出现了 MRSA 菌株，存在着 抗生素滥用及乱用的现象。其中耐消毒剂基因 qac-a 的检测中，在总样本 中金葡菌中共检测出了 13 株。这说明在山东省的某些牛场里存在着消毒剂 的不规范使用，在剂量和各种消毒剂的优化配