金黄色葡萄球菌agr缺失突变株的构建-急诊医学专业论文.docxVIP

温州医学院硕士学位论文摘要 温州医学院硕士学位论文 摘要 金黄色葡萄球菌agr缺失突变株的构建 目的 金黄色葡萄球菌是导致社区与医院内感染最主要的病原体之一，可以引起人 体局部和全身的感染。金黄色葡萄球菌可以分泌大量的外毒素，致病力强。杀白 细胞素(Panton—Valentine Leukocidin，PvL)是社区获得性金黄色葡萄球菌 (community-acquired MRSA，CA．MRSA)的重要毒力因子，PVL的致病作用近 些年受到广泛关注。金黄色葡萄球中的葡萄球菌附属基因调节子(accessory global regulator,agr)有着重要的功能，在细菌的毒力调节及生物膜的形成中起着重要作 用。为了深入研究agr系统对PVL表达的调节作用，我们利用同源重组技术构 建了一株临床分离金黄色葡萄球菌的卿缺失突变株，对其与PVL转录的相关 性进行研究。 方法 选取agr，lukS-P堪因阳性，药敏试验显示对氯霉素敏感的金黄色葡萄球菌 临床分离株SA75，厍JPCR扩增金黄色葡萄球菌临床分离株的卿基因上下游同源 臂，插入质粒pKORl中，将pKORl．A agr质粒电转入金黄色葡萄球菌RN4220中 进行修饰，再将pKORl．4 agr质粒电转入金黄色葡萄球菌临床分离株中。将含有 重组质粒的金黄色葡萄球菌临床分离株经一系列变温传代培养，使用脱水四环素 筛选硼失可疑突变株，对筛选到的可疑突变株基因序列和转录产物进行检测。 确认构建成功后，使用相对荧光定量PCR检测相关基因表达水平变化。 结果 金黄色葡萄球菌临床分离株于201 0年2月分离自温州医学院第一附属医院 一皮肤软组织化脓性感染患者的脓液标本，经革兰染色、血浆凝固酶实验及全自 动微生物分析仪鉴定为金黄色葡萄球菌，经PCR证实agr基因阳性，IukS-PV基 因阳性；将agr基因上游片断的PCR产物(1000bp)、agr基因下游片断的PCR 产物(1000bp)两者连接后插入质粒pKORl，成功构建pKORl．A agr。同源重 组质粒pKORl．4 agr先被电转入金黄色葡萄球菌RN4220进行修饰，然后再电 转入金黄色葡萄球菌临床分离株。提高已转入pKORl．Aagr的金黄色葡萄球菌 的培养温度(42℃)，之后降温进行培养(30℃)，促进同源重组的发生，利用脱 水四环素的诱导凋亡进行筛选，获得疑似突变株。在agr基因上游片段的上游和 下游片段的下游各设计一条引物，以agr缺失突变株的染色体基因组DNA为模 板进行扩增，得到的片段比野生株SA75基因组DNA为模板扩增得到的片段要 少3000 bp。将扩增得到的产物进行测序分析，发现agr基因缺失。将突变株的 温州医学院硕士学位论文总cDNA为模板扩增agr基因，未能得到特异性的产物，符合预期。所获突变株 温州医学院硕士学位论文 总cDNA为模板扩增agr基因，未能得到特异性的产物，符合预期。所获突变株 采用全自动微生物分析仪进行菌种鉴定，确认为金黄色葡萄球菌。分别抽提4 h、 6 h、8 h和12 h四个时间点的原临床分离株和agr缺失突变株的RNA，逆转录 为cDNA。使用实时荧光定量PCR对lukS-PVmRNA进行检测，以gyrB基因表 达量为内参。SA75一A agr突变株IukS-PVmRNA量在4 h、6 h、8 h和12 h四个 时间点均有下降，分别为SA75野生株的22．4％、46．0％、35．7％和33．3％。 结论 金黄色葡萄球菌酬失突变株的成功构建，为研究agr系统与PVL之问的调 控关系提供了必要的实验菌株。在4h、6h、8h和12h四个时I司点， agr缺失突变 株的htkS-PVmRNA表达量与野生株相比均有下降。研究表明：金黄色葡萄球菌 临床分离株SA75中孵基因与PVL的表达关系为正相关。 关键词： 金黄色葡萄球菌；agr；同源重组；基因敲除： —————————————————●————————————————————————J—————————————一——————————————————一 —————————————————●————————————————————————J—————————————一——————————————————一塑型堕堂堕堡±堂篁堡兰—— Abstract The C onstruction of agr Gene Knockout Mutants in StaphyIococcus aureus Objective Staphylococcus aureus causes partial and／or systemic infections and the