金黄色葡萄球菌B型肠毒素的溶液构象及菌体生长环境效应-农产品加工及贮藏工程专业论文.docxVIP

金黄色葡萄球菌B型肠毒索的溶液构象及菌体生匠环境效应摘要 金黄色葡萄球菌B型肠毒索的溶液构象及菌体生匠环境效应 摘要 金黄色葡萄球菌(SaphyJoooccus aUr口US)是人类和某些动物的病原菌之一， 其致病力强弱主要取决于产生的毒素和侵袭性酶的能力，其中金黄色葡萄球菌耐热 性肠毒素，是引起人类食物中毒和葡萄球菌胃肠炎的主要原因，因此，这方面的研 究已成为科学家们普遍关注的重要课题。本文以主要产B型肠毒素的金黄色葡萄球 菌s6菌株为研究对象，采用x一射线衍射、扫描电镜、原子力显微镜、分子振动光 谱(红外、激光拉曼)、圆二色谱、荧光光谱等现代分析技术表征金黄色葡萄球菌B 型肠毒素(staphylococcal enterotoxin B，简称SEB)的聚集态结构、三维立体形 貌、分子链构象及蛋白质二级结构组成。同时着重研究了肠毒索在稀溶液状态和外 界环境改变时的构象特征及可能的去折叠过程，尝试用蛋白质构象理论揭示肠毒素 耐热的根本原因，寻找其耐热的可能优势构象，建立研究蛋白质构象与生物学活性 相关性的新方法。此外，还从酸奶发酵菌株和金黄色葡萄球菌的混合培养特性出发， 研究了乳酸菌及代谢产物对金黄色葡萄球菌的抑制作用及其在抑制过程中热效应的 微量变化，从热化学的角度探讨其作用机制。主要研究结果如下： 1．金黄色葡萄球菌B型肠毒素的分离纯化 采用玻璃纸覆盖琼脂平板法培养金黄色葡萄球菌，首先利用羧甲基纤维素阳离 子CM．32柱层析，对B型肠毒索进行初步分离富集，然后依据筛分原理按分子量大 小经Sephadex G．75凝胶迸一步纯化，得到电泳纯B型肠毒索，得率为26．8％，紫 外吸收光谱测得其特征吸收峰为276．6nm，SDS．PAGE凝胶电泳分析其相对分子质 量为2．8×104，与文献报道值一致。 2．金黄色葡萄球菌B型肠毒素的结构表征 利用X一射线衍射、扫描电镜、原子力显微镜、傅里叶交换红外光谱、激光拉曼 光谱等现代分析手段对金黄色葡萄球菌B型肠毒索的聚集态结构、分子链形态，二 级结构等进行了表征。结果表明，SEB为一种单纯蛋白，其聚集态包含结晶区和无 定形区，结晶度为37．8％，其分子聚集在一起，形态主要为片状和平板状，具有一 定的规整性。原子力显徽镜首次观察到SEB在稀溶液状态下的单分子链长度约为 1500nm，分子链宽度约为20～40nm，分子链高O．6nm。SEB的傅里叶变换红外光 谱和激光拉曼光谱分析表明，SEB的=级结构单元主要为B一折叠和a一螺旋，无 规卷曲含量较少，侧链c—C—s—s—c—c构型为反式一扭曲一反式。 3．金黄色葡萄球菌B型肠毒素的稀溶液构象及去折叠作用 研究大分子的溶液构象和蛋白质的去折叠作用是近来揭示蛋白质生物活性及其 与高级结构相关性的重要切入点。金黄色葡萄球菌B型肠毒素水溶液(浓度为 VI 2005扁华中农业大学博士学位论文O．02mol／L)在25℃的远紫外CD谱显示，其二级结构各构象单元含量分别为：a一 2005扁华中农业大学博士学位论文 O．02mol／L)在25℃的远紫外CD谱显示，其二级结构各构象单元含量分别为：a一 螺旋22．6％、13一折叠40．4％、转角19．2％和无规卷曲17．7％，说明SEB属于B一 折叠含量较高的蛋白质。在50～121 4C温度范围内，随着温度的升高，SEB二级结构 中的n一螺旋含量逐渐下降，从25℃时的22．6％降为95℃的9．6％，在121℃时，u 一螺旋完全消失。同SEB二级结构中a一螺旋变化相反，B一折叠含量则相对保持稳定， 仅在75℃时其含量为8．5％，而在其它温度处理下，含量均在30．2％以上，121℃时 仍保持39．9％，温度变化(除了75℃外)几乎不能引起SEB去折叠，由此说明B一 折叠是保持SEB二级结构稳定性的优势构象单元。SEB经121℃处理后的激光拉曼光 谱显示，表征其二级结构的d一螺旋和二硫键谱带消失，而在1672cm_1处仍保持D一 折叠的特征谱带，同样证实SEB是一种热稳定性强的蛋白质．从分子水平探讨了肠 毒素热稳定性的机理，这一结论未见文献报道。 本实验通过CD和荧光光谱分析研究了SDS、脲和乳酸链球菌索对稀溶液中SEB 构象的影响。实验表明，SDS和乳酸链球菌素均能使SEB构象单元中的a一螺旋含 量下降，B一折叠和无规则卷曲含量增加，但仍然保持B一折叠的主导结构，说明SDS 和乳酸链球菌素对SEB不具有减毒或灭活作用。脲的作用相反，它能使SEB二级结 构中的a一螺旋构象单元的含量显著增加，而B一折叠和无规则卷曲消失，转化为转 角结构，起到去折叠的作用，从而证实了脲处理并不能使变性的肠毒索恢复活性而 有利于检测这一推测。 荧光光谱研究表明，在不同浓度脲的作用下(脲浓度依次为0、O．1、1、2、3、 4、5、6m