金黄色葡萄球菌CapB2的致病作用及表达调控机制研究-临床检验诊断学专业论文.docxVIP

温州医科大学硕士学位论文中文摘要 温州医科大学硕士学位论文 中文摘要 金黄色葡萄球菌CapB2的致病作用及表达调控机制研究 目的 金黄色葡萄球菌是常见的条件致病菌，能够表达大量的毒力蛋白，可导致多 种临床疾病，而金黄色葡萄球菌的毒力由众多调控因子所调控的毒力基因所决 定。荚膜多糖(capsular polysaccharide，CP)的产生与金黄色葡萄球菌的致病力 有关，是金黄色葡萄球菌一种重要的免疫逃逸机制，其中capB2是合成荚膜多糖 的重要组成部分，其致病作用受到广泛重视。葡萄球菌辅助调控因子 (Staphylococcal accessory regularA，sarA)在调控金黄色葡萄球菌毒力方面的作 用非常重要。本研究旨在为了解CapB2在金黄色葡萄球菌致病方面的作用及其 表达调控机制。 方法 利用PCR法扩增金黄色葡萄球菌临床分离株75(SA75)荚膜多糖的型特异性区 域对SA75进行荚膜多糖基因分型。PCR扩增SA75的capB2基因上、下游同源 臂，通过特定的酶切位点连接不含目的基因的上、下游片段，然后通过同源重组 反应构建质粒pKORl．A capB2，将重组质粒转入大肠埃希菌DCl0B进行修饰， 再电转入SA75菌株中。经过变温传代和四环素的诱导，筛选出capB2基因缺失 突变菌株(4 capB2)。利用PCR、实时荧光定量PCR(Quantitative real．time PCR， qPCR)和基因测序对A capB2筛选子进行鉴定。分别扩增含启动子和核糖体结 合位点(Ribosome Binding Site，RBS)的sara基因全长和capB2基因的编码区 序列，选择合适的酶切位点将回复基因与质粒pRB473连接，将重组回复质粒热 转转入大肠埃希菌DCl0B感受态细胞中，最后转入A capB2和sara缺失突变株 (dsarA)中，经qPCR和测序鉴定回复成功。待基因缺失突变株及互补表达株 构建成功，建立皮肤脓肿模型比较A capB2、A capB2．C与野生株之间的毒力差 异，确定capB2在金黄色葡萄球菌致病中的作用，并取脓液标本进行电镜观察， 分析各组细菌间微荚膜厚度差异。使用qPCR的方法检测调控因子sara与金黄 色葡萄球菌capB2基因间的调控关系。 结果 荚膜基因分型结果经测序证实本实验所使用的SA75属于8型荚膜多糖 (CP8)。将capB2上、下游1500 bp片段先后与克隆载体pET28a连接，通过 同源重组反应构建pKORl-AcapB2重组质粒，转入大肠埃希菌DCl0B，最后电 转入SA75菌株中发生同源重组，经筛选、测序确证后得到zlcapB2。基因缺失 2 万方数据 温州医科大学硕士学位论文突变株和互补表达株构建成功后，绘制野生株、缺失突变株和互补表达株的生长 温州医科大学硕士学位论文 突变株和互补表达株构建成功后，绘制野生株、缺失突变株和互补表达株的生长 曲线，发现各菌株之间的生长曲线并无明显差异。通过皮肤脓肿模型实验研究 capB2基因所编码的蛋白的功能。研究结果发现于感染的第4、5、6、7天，细 菌4capB2组的脓肿面积明显小于野生株SA75组，回复了capB2基因的互补表 达株4 capB2．C组的脓肿面积恢复到野生株水平。感染的第二至第十天，敲除株 和互补表达株之间的脓肿面积差异均具有统计学意义(P0．05)，整个感染过程 中野生株和回复突变株之间的差异均不明显(P0．05)。电镜结果显示，4capB2 组的微荚膜厚度最薄，互补表达株A capB2．C组的微荚膜厚度恢复到接近野生株 组水平。在调控关系上，提取Asara、AsarA．C和野生株SA75细菌总RNA， qPCR检测各菌株capB2基因表达水平的差异。我们发现与野生株相比，A sarA 株中capB2表达量上调326倍，而回复了sarA基因的A sarA．C，capB2的表达 水平恢复到接近野生株水平，提示sarA能抑制capB2基因的表达，对capB2具 有负调控的作用。 结论 1、本实验构建了金黄色葡萄球菌SA75的基因缺失突变株△capB2和基因互补 表达株A capB2．C和A sarA．C。 2、成功构建裸鼠皮肤脓肿模型，证实了capB2是金黄色葡萄球菌的毒力因子。 3、金黄色葡萄球菌SarA负调控capB2基因的表达 关键词：金黄色葡萄球菌，capB2，sarA，毒力因子 3 万方数据 AbstractPathogenic Abstract Pathogenic Function of Staphylococcus aureus CapB2 and Its Regulation Mechanism objective Staphylococcus altrelts is