金黄色葡萄球菌氨基糖苷类、喹诺酮耐药基因的研究-内科学(传染病学)专业论文.docxVIP

广东药学院硕士研究生学位论文 广东药学院硕士研究生学位论文 目 录 HYPERLINK \l _bookmark0 中文摘要 I HYPERLINK \l _bookmark1 Abstract III HYPERLINK \l _bookmark2 前 言 1 HYPERLINK \l _bookmark3 第一章 金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶耐药基因与氨基糖苷类耐药的相关性研究 6 HYPERLINK \l _bookmark4 1.1 实验材料 6 HYPERLINK \l _bookmark5 1.2 实验方法 8 HYPERLINK \l _bookmark6 1.3 结 果 17 HYPERLINK \l _bookmark7 1.3.1 SA 的培养及鉴定 17 HYPERLINK \l _bookmark8 1.4 讨 论 23 HYPERLINK \l _bookmark9 第二章 金黄色葡萄球菌氟喹诺酮 NORA 耐药基因的克隆与表达 25 HYPERLINK \l _bookmark10 2.1 材料与方法 26 HYPERLINK \l _bookmark11 2.2 实验方法 28 HYPERLINK \l _bookmark12 2.3 结 果 34 HYPERLINK \l _bookmark13 2.3.1 SA NORA 基因的 PCR 结果 34 HYPERLINK \l _bookmark14 2.4 讨 论 41 HYPERLINK \l _bookmark15 第三章 广州地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的临床分布及耐药性分析 43 HYPERLINK \l _bookmark16 3.1 材料与方法 43 HYPERLINK \l _bookmark17 3.3 讨 论 46 HYPERLINK \l _bookmark18 结 论 49 HYPERLINK \l _bookmark19 参考文献 50 HYPERLINK \l _bookmark20 综述 54 HYPERLINK \l _bookmark21 附录： 缩略词 61 HYPERLINK \l _bookmark22 致 谢 62 I I 金黄色葡萄球菌氨基糖苷类、氟喹诺酮类耐药 基因的研究 中文摘要 目的： 金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus(SA)]是人类化脓感染中最常见的病原菌， 可引起局部化脓感染，也可引起肺炎及败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球 菌是院内感染的常见细菌之一，许多国家都设有专门机构，应对金葡菌的院内感染 问题。随着内酰胺类抗生素的广泛应用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)随之增 加，且引起的感染和病死率有逐年增加的趋势。MRSA 可通过接触途径进行传播， 即易感人群从携带者或感染者身上获得 MRSA，导致传播流行。腺苷酰转移酶是一 种跨膜多重药物外排蛋白，介导了葡萄球菌对氨基糖苷类药物(主要是亲水性氨基糖 苷类药物)及多种结构上近似甚至无关的药物耐药。该菌对多种广谱抗菌药物耐药， 给临床治疗带来很大困难。因此，对其耐药机制、耐药基因的传播与转移的研究具 重要的临床意义。 本研究首次对临床分离 SA 氨基糖苷类耐药基因 adenylyltransferase gene、氟喹 诺酮耐药基因 NorA 进行克隆、测序、表达及初步功能研究，为进行 Adenylyltransfe rase、NorA 蛋白高级结构测定的结晶试验提供必须材料，同时对耐药基因的深入功 能研究奠定基础，为从分子水平开展医院 SA 耐药株感染的控制和监测提供依据。 方法： 取 SA 临床分离株复苏、鉴定。采用离心柱型 DNA 抽提纯化试剂盒提取 SA 染色 体 DNA，根据 Genbank 公布的 SA 基因序列设计特异性引物，以染色体 DNA 为模 板，通过 PCR 技术扩增 adenylyltransferase、NorA 全基因，PCR 产物纯化后与 pGEX-4t-1 载体连接，连接产物转化大肠杆菌 E.coli DH5α， 挑取经氨苄筛选的阳性 菌落提取质粒并经双酶切及测序鉴定。转化大肠杆菌 E.coli BL21， 经双酶切鉴定后 广东药学院硕士研究生学位论文 广东药学院硕士研究生学位论文 II II 以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌表达，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝 胶 电 泳 （ SDS） 及 免 疫 印 迹 法 （ Western blot ） 分 析 表 达 结 果 ； 并 对 pGEX-4T-1-adenylyltransferase /BL21 重组株进行氨基糖苷类类药敏实验