金黄色葡萄球菌毒力分型及其毒素致乳腺上皮细胞凋亡的研究-食品科学专业论文.docxVIP

i i 单 位 代 码 10445 学 号 2008021154 分 类 号 Q93 研究生类别 全日制硕士 硕 士 学 位 论 文 论文题目 金黄色葡萄球菌毒力分型及其毒素致乳 腺上皮细胞凋亡的研究 学科专业名称： 食品科学 申请人姓名 ： 王飞 指 导 教 师 ： 刘代成 教授 杨宏军 副研 论文提交时间： 2011 年 04 月 20 日 ii独 创 声 明 ii 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 （注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名： 导师签字： 学 位 论 文 版 权 使 用 授 权 书 本学位论文作者完全了解 学校 有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权 学校 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在 解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 导师签字： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日 山东师范大学硕士学位论文 山东师范大学硕士学位论文 山东师范大学硕士学位论文 山东师范大学硕士学位论文 i i ii ii 目录 目录 i 中 文 摘 要 I Abstract III 第一章 文献综述1 1. 奶牛乳腺炎流行病学、病原学、病因和防治1 1.1 奶牛乳腺炎的流行、危害及病因1 1.2 金黄色葡萄球菌综述4 1.3 奶牛乳房炎 SCC 数据结合 CMT 方法诊断 6 2 金葡菌相关基因的分型检测及热点基因检测研究进展7 3. 金黄色葡萄球菌毒力因子致乳腺细胞损伤及凋亡9 4 本课题研究的目的及意义 11 4.1 分型的目的及意义 11 4.2 研究细胞凋亡的意义 11 4.3 本课题的主线及预期12 第二章 牛源金葡菌的分离和鉴定13 1 材料与方法13 1.1 奶样及菌株13 1.2 试剂13 1.3 主要仪器13 1.4 培养基及重要试剂制备13 1.5 乳样的采集13 2 金葡菌的培养及分离14 3 金葡菌鉴定14 3.1 过氧化氢酶试验14 3.2 发酵试验15 3.3 血浆凝固酶试验15 3.4 耐热核酸酶检测15 3.5 ATB 系统再次鉴定 15 4 模板提取、引物设计及 PCR 反应 15 4.1 金黄色葡萄球菌 DNA 的提取 15 4.2 金黄色葡萄球菌各种毒力因子 PCR 鉴定引物的设计与和合成 15 4.3 PCR 反应条件、电泳及测序 16 5.结果17 5.1 hla 及 hlb 基因检测 17 5.2 pvl 生化及基因检测 18 5.3 coa 基因检测 18 5.4 nuc 基因检测 19 5.5 mec-a 基因检测 19 5.6 qac-a 基因检测 19 6 生化检测与基因检测结果汇总20 7 分析与讨论21 HYPERLINK \l _TOC_250002 hla 与 hlb 21 HYPERLINK \l _TOC_250001 mec-a 与 qac-a 22 HYPERLINK \l _TOC_250000 pvl 23 7.4 coa（凝固酶）基因检测 24 7.5 nuc（耐热核酸酶）基因检测 24 本章小结25 第三章 重组 α-溶血素致乳腺细胞凋亡的研究 26 1 试验材料26 1.1 试验动物26 1.2 菌种和质粒26 1.3 主要试剂26 1.4 主要试剂的配制27 1.5 主要仪器27 2 实验方法28 2.1 α-HL 目的蛋白和 pET-32a(+)空载体的诱导表达和纯化 28 2.2 目的蛋白的定量检测28 2.3 小鼠乳腺细胞培养及重组 α 溶血素互作 29 3 结果与分析30 3.1 重组 α-溶血素的基因表达与 SDS鉴定 30 3.2 细胞培养形态与鉴定30 3.3 蛋白标准曲线的制作与目的蛋白含量测定31 3.4 乳腺细胞液中细胞因子的变化32 3.5 数据统计与分析33 3.6 结果33 3.7 对乳腺上皮细胞中 TNF-?、IL-2 和 IL-6 水平的影响 36 第四章 结论37 参考文献38 致 谢42 攻读学位期间发表的学术论著43 I I PAGE PAGE IV 金黄色葡萄球菌毒力分型及其毒素致乳腺上皮细胞凋亡的研究 中 文 摘 要 本实验对山东及周边牛场做了乳房炎的检测，采集并分离了129株金黄