食源性细菌分子生物学检测.pptVIP

* * 食源性细菌的分子生物学检测 近年来，随着分子生物学技术的迅速发展， 很多适合于食源性细菌检测和分析的分子生物学方法，这些方法具有操作简便、快速、灵敏度高等特点，通常只需24～48 h就可以获得检测结果。 核酸分子杂交和PCR技术， 相当成熟和完善 一、样品的前处理 获得一定纯度和一定数量的靶细菌(待检测目标细菌)的DNA作为分子杂交的材料或PCR的模板。 食品的组成复杂，而且食品中除了有靶细菌外，往往还存在很多非靶微生物， 在很多情况下从食品样品中获得靶DNA所消耗的时间、精力和费用往往比应用分子生物学技术检测它们要长(高)得多。 前处理主要包括靶细菌的富集浓缩 样品中PCR抑制剂的去除 (一)靶细菌的富集 虽然有些分子生物学技术，例如增敏PCR能够检测出样品中很少数量甚至一个靶细菌， 为提高灵敏度和检测结果的可靠性，往往需要对样品中的靶细菌进行富集。（5种） 1、 采用选择性培养基成分和选择性培养条件富集 增殖 可增加靶细菌 ，还可以降低样品中对分子生物学技术存在干扰的物质（PCR抑制剂）， 增殖培养还可使一些处于亚活力状态的细菌恢复活力，从而提高检测的灵敏度和准确性. 2．离心或过滤方法 浓缩靶细菌，增加 靶细菌相对数量的方法。它无需对样品增殖培养，因此不会延长检测时间，也不破坏“原始性”， 一般仅适合于牛奶等液体食品。 3．免疫吸附富集法 免疫磁珠分离技术(immunomagnetic separation techniques 免疫乳胶分离技术(immuno-latex separation techniques) 与离心过滤方法一样，由于无需培养，因此不会延长检测时间，也不会破坏样品的“原始性”。 4、外源凝集素(1ectin)凝集法：外源凝集素（植物糖蛋白），它能与细胞质膜上的特定碳水化合物结合，靶细菌通过和包被在固体微粒上的外源凝集素结合而被分离富集 5、电分离方法(electrofractionation) 是根据靶细菌和其他物质(包括非靶微生物和各种化合物)所带的电荷不同而实现分离富集的方法。 免疫磁珠分离技术用得最多和最成功。 (二)PCR抑制剂 去除方法 PCR的抑制剂来自： 1、 样品本身所含有的各种物质： 组成成分，例如酚类 、糖类物质、蛋白质、脂肪和Ca2+等 、腐殖酸、重金属离子、抗生素、洗涤剂和其他非靶微生物等 。 2、 DNA提取 使用的各种试剂 各种污染物。 抑制因子通过降解靶DNA，以及部分或完全抑制靶DNA的扩 增，从而影响PCR的结果，导致出现假阴性或假阳性，降低检测的灵敏度，甚至使PCR扩增完全失败。 样品中含有抑制物而导致PCR的灵敏度降低是最常见的现象。例如理论上，在 1 g食品中含有100个靶细菌就可以通过PCR检测出来，但在实际中， 有报道当软奶酪样品中的细菌在高达2 000～200 000CFU／g时，才能检测出来， 当奶粉样品中的金黄色葡萄球菌数高达100 000CFU／g时，才能检测出来。分析认为， 样品中蛋白质降解产物都可能是影响检测灵敏度的原因。 (三)死亡靶细菌对PCR扩增结果的影响 一般地，已死亡的细菌是不会危害健康的，但是有时它的(特别是加热杀死细菌)的DNA常可作为PCR的模板而得到扩增，出现假阳性，影响PCR的分析结果。 PCR的分析结果是由于已死亡靶细菌DNA产生 ，还是活的靶细菌DNA产生的结果 ? 1、用培养增殖先对样品中的靶细菌进行短时间的选择性培养增殖，然后对增殖前后的靶细菌DNA进行扩增，如果样品中没有活的靶细菌，那么增菌前后DNA的扩增结果应该没有差别 2 、反转录PCR(RT-PCR) 分析样品中靶细菌的