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实验二 外植体的灭菌与接种 一、实验目的 　　通过实验，初步掌握外植体植物材料消毒、接种的无菌操作技术以及外植体愈伤组织诱导和分化的方法。 二、实验原理 植物组织培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官或组织，甚至单个细胞的过程。 如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料去进行组织培养，这是取得组织培养成功的最基本的前提和重要保证。 植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织。 植物生长调节剂是诱导外植体形成愈伤组织和愈伤组织分化的重要影响因素。 消毒目的：通过表面消毒剂杀死植物材料(外植体)表面微生物,同时要尽可能保持植物材料的生命力。 三、实验材料、试剂及器具 (1)材料：烟草叶片 (2)试剂及培养基 10% ＮaClO (全班配2000mL) 75%乙醇 (全班配2000mL,已配) 无菌水 0.1%新洁尔灭 (全班配2000mL，已配) 烟草叶片的培养基(8组) (3)器具：超净工作台、无菌吸水纸、脱脂棉花、标签纸、记号笔、酒精灯、烧杯、镊子、剪刀、解剖刀等 四、操作步骤 培养基、用具灭菌(实验一已完成) 接种注意事项 接种前75%酒精或0.1%新洁尔灭擦手 进入接种室:穿已灭菌工作服, 换拖鞋 接种时尽量不要说话(防交叉污染) 不要在接种室来回走动(防超净工作台气流波动) /v_playlist/f1461876o1p5.html 　/v_show/id_XMTE2NzgwNjg=.html 超净工作台的使用 接种前，用75％酒精棉球或用1%新洁尔灭溶液擦拭超净工作台台面 将培养基及接种用具放入超净工作台台面 打开超净工作台紫外灯，照射约20～30 min 关闭紫外灯，打开送风开关 通风10 min后,开日光灯即可进行外植体的消毒和接种等无菌操作 标签格式(例) 材料名称:烟草(叶) 培养基名称:MS+NAA2mg/L+6-BA1mg/L 接种日期: xxx 姓名:xxx 五、观察记录 观察污染情况 细菌性污染:菌斑呈粘液状,接种后1-2天出现 真菌性污染:出现不同颜色(霉菌),接种后3-10天出现 材料发黄,组织变软,可能是因消毒时间过长,组织破坏死亡 污染率(%)=污染的材料数/接种材料总数×100 观察愈伤组织情况 愈伤组织出现时间 愈伤组织形态特征 颜色 质地 诱导率(%)=形成愈伤组织的材料数/接种总材料数×100 如污染严重或没有诱导出愈伤组织,则需重做实验! * * 打开超净工作台紫外灯20min,关灯后要等20min才能进入实验室 进入接种室:穿已灭菌工作服, 换拖鞋,接种前75%酒精或0.1%新洁尔灭擦手 选取外植体 自来水冲洗 75%酒精浸泡30s １０％ＮaClO 浸泡15-20min 无菌水冲洗4-5次 无菌吸水纸吸干 分割成边长为0.8~1cm的正方形 火焰上方接种 盖紧瓶盖 培养 在超净工作台上进行 贴标签 清理超净工作台