实验五 细胞内NA的显示.pptVIP

细胞内DNA的显示 实验目的 实验原理 实验方法及步骤 作业 一、实验目的 学习DNA的Feulgen染色方法 了解DNA的Feulgen染色反应原理 观察DNA的Feulgen染色结果 二、实验原理 标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红与醛基反应形成含有醌基的化合物, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。 三 实验方法及步骤 ⑴ 牛蛙血涂片（室温干燥） ↓ ↓ 正常反应片 对照片 ↓ ↓90℃三氯醋酸20min ↓ 蒸馏水略洗 ↓ ↓ ⑵ 稀酸水解:1mol/L盐酸 ↓冷 3 min 1mol/L盐酸 ↓60℃水浴5-12 min（五个时间梯度） 1mol/L盐酸 ↓冷略洗 ⑶ 染色: Schiff氏试剂 ↓暗盒避光30 min ↓ 亚硫酸水溶液I，II，III ↓各3 min ⑷ 水洗：流水冲洗 ↓ 蒸馏水 ↓略洗 镜检 四、作 业 1. 绘图表示牛蛙血细胞中DNA的分布。 2. 简述Feulgen反应的关键步骤。 * * 接上页“暗盒避光30min” 鼻咽癌癌细胞的细胞核呈空泡状 核酸是最重要的生物大分子之一，它和蛋白质一起构成生命的主要物质基础。核酸的最主要的生物学功能是它直接参与生物遗传信息的传递过程.在真核细胞中DNA主要分布在细胞核中,并与蛋白质结合形成核蛋白,构成染色质(体)的主要成分.在线粒体和叶绿体中也有少量DNA存在。 Feulgen反应：自从1924年Feulgen等人建立了DNA-Feulgen染色方法以来,至今这种方法仍是DNA定量测定的主要染色方法之一。Feulgen染色是经典显示去氧核糖核酸的方法 。 具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。 Feulgen反应的结果及应注意的问题 一、Feulgen反应的结果：由于DNA主要分布在细胞核，所以经Schiff氏试剂反应着色后，细胞核呈现深紫红色，而细胞的其它部分无色，如用亮绿复染,则细胞质和核仁呈现浅绿色。 二、Feulgen反应应注意的问题： 　　⑴ 对照片：做对照实验为了检验Feulgen反应的阳性的可靠程度，对照切片应不经水解直接放在schiff剂内，且应为负反应。但需要注意的是，对照切片在schiff试剂中最多不要超过1 h (0.5 h即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水解，从而出现假的正反应。最好用DNA酶消化细胞材料，取得Feulgen阴性反应作为对照如果没有DNA酶，也可以用5%三氯醋酸抽提核酸作为阴性反应对照。 　　⑵ 稀酸水解的时间 Feulgen反应的一个关键步骤是水解DNA,使其释放出游离的醛残基,但水解时间要适宜。若水解时间不够,嘌呤硷脱落不下来,反应就变弱;反之,若水解时间过长,则可使DNA和蛋白质过度降解,使反应变弱,甚至呈阴性反应。 稀酸水解的时间一般为5-15 min,随动植物种类以及固定剂的不同而异。 　　⑶ Schiff氏试剂的质量: Schiff氏试剂的好坏直接影响着DNA的呈色反应,所以应选用质量好的碱性品红来配制Schiff氏试剂,并注意避光保存,防止氧化变红失效。１２３２１  设备： 全班需要四个装有5%三氯醋酸的染色缸，于边台90℃水浴锅内加热。 每小组一个小烧杯，五个染色缸，两个装1Mol/L的Hcl（一个装室温的Hcl，另外一个放在60℃的水浴锅内加热），其