医学免疫学酶免疫技术.pptVIP

酶免疫技术 基本概念 抗原抗体反应具有高度特异性 酶对底物反应具有高效催化性 酶免疫技术是将两者有机的结合起来 通过化学方法将酶与抗原（抗体）连接，形成酶标物 抗原抗体反应后，观察酶所对应的底物显色情况 检测方法具有高度特异、高度灵敏的优点 按应用的实际目的分为 酶免疫组织化学技术（EIHCT） 用于组织切片或其他标本中的抗原定性、定位的检测 酶免疫测定（EIA） 酶免疫测定 用于检测标本中抗原（抗体）定性或定量的检测 　 Ag -E + Ab E -Ag-Ab 游离的抗原、抗原抗体复合物上都有酶分子 反应结束后，免疫反应的进行与否及程度，通过反应体系中的酶活性来体现 均相酶免疫测定 　　特殊设计的酶标物，使反应结束后，不需分离游离和结合状态的酶标物，即可对反应作出判定 非均相酶免疫测定 需分离游离和结合状态的酶标物，通过检测结合状态的酶活性，对反应作出判定 ELISA 基本原理 将抗原（抗体）连接在固相载体上，保留免疫学活性 将抗原（抗体）与酶连接，形成酶标物，保留各自的活性 按一定的步骤在固相载体上，分别加入待测标本和酶标物 充分反应后，通过洗涤去除游离物质 在固相载体上加入底物，测定底物的显色情况（肉眼、酶标仪）对待测物质作出定性或定量的判定 技术要点 包被 酶结合物及底物 洗涤液 酶标仪 包被 将抗原（抗体）连接在固相载体上的过程称为包被　 固相载体的选择 对蛋白质有较强的吸附力 本身不参加免疫反应或化学反应 空白值低、孔底透明 价格低廉、来源广泛 聚苯乙烯制成的微量反应板为最常用的固相载体 过程 确定免疫吸附剂（抗原、抗体）最适工作浓度 将抗原/抗体用50mmol/L CB溶解至最适工作浓度加至固相载体上，4℃过夜或37℃2～6小时，洗涤 用无关的蛋白质对反应板上未被占据的空隙进行封闭，洗涤，低温下保存 固相Ag 固相Ab 酶结合物 酶的选择 活性高、性质稳定 作用专一、受检标本对酶活性影响小 易与抗原（抗体）结合，保留各自活性 检测酶活性方法简单、灵敏，底物易配制、保存 酶、辅助因子及底物对人体无害 酶及底物价廉、来源广泛 辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）常用 酶结合物 HRP 分子量小（40KD），易透入细胞 标记方法简单 性质稳定（pH、温度、有机溶剂） 易溶 价格便宜、易得 底物种类多 内源性的过氧化物酶有干扰、某些化学物质抑制其活性 标记方法 改良过碘酸钠标记法 HRP-CH2-OH NaIO4 HRP-CHO +H2N-IgG HRP-CH2-NH-IgG -戊二醛交联标记法 底物 HRP催化的反应 　H2O2＋DH2（无色）＝2H2O＋D（有色） ELISA中常用的底物 OPD TMB 保存 避光稳定 不稳定，现配 产物 黄色、可溶 蓝色、可溶，加终止液后变黄色 比色波长 492nm 450nm 免疫组化中常用的底物为DAB，被酶作用后生成棕色不溶物质 洗涤液 由表面活性物质吐温20（Tween20）与缓冲液组成 作用 增强抗原抗体的结合 去除未结合的游离物质 减少非特异性吸附 注意事项 加洗涤液后静置数秒 勿溢出至其它孔，导致孔间污染 每次需将洗涤液拍干 洗涤次数为4～5次 酶标仪 ELISA试验结果根据底物的显色情况加以判定 按要求需用酶标仪进行检测 酶标仪是通过检测反应孔中液体吸光度来判断颜色的深浅 注意事项 比色前需加终止液 常用2mol/L硫酸或盐酸 目的　终止酶促反应、促使吸收峰转变 阴性对照测定值对结果的判断至关重要 已知不含待测物的标本为阴性对照品 除竞争法外，结果判定为 A待测/A阴性≥2.1　待测标本判为阳性 A待测/A阴性＜2.1　待测标本判为阴性 ELISA的技术类型 检测抗原 双抗体夹心法 双位点一步法 竞争法 双夹心法 桥联法 检测抗体 间接法 双抗原夹心法 竞争法 桥联法 捕获法 双抗体夹心法 原理 固相抗体 酶标抗体 底物 显色 无关抗原 洗涤液 如待测标本中有相应抗原最后形成固相抗体、待测抗原和酶标抗体复合物，加底物显色，结果判定为阳性。显色深浅正比于待测抗原的浓度 用于大分子抗原的检测。例：HBsAg、HBeAg 双位点一步法 原理 为双抗体夹心法的改良 待测抗原必须具有两个以上的决定簇 固相抗体、酶标抗体为分别针对待测抗原两个不同决定簇的单克隆抗体，称为双位点 将待测抗原与酶标抗体同时加入反应孔中，为一步法 注意可能出现钩状效应 钩状效应 在ELISA双位点一步法中待测抗原浓度过高导致结果的假低值甚至假阴性，它不同于带现象 固相抗体 酶标抗体 洗涤液 酶标抗体 　　 底物 必要时，可将标本进行稀释，以消除钩状效应 竞争法 原理 无抗原 固相抗体 固相抗体 底物 底物 显色为阴性、不显色或显色浅为阳性，待测抗原的含量与显色的深浅成反比。用于小分