人胰岛素的制备.docVIP

b b 人胰岛素的制备 获得目的基因 从供体细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成胰岛素mRNA互补DNA，再以cDNA第一链为模板，在反转录酶或DNA聚合酶I的作用在，最终合成编码它的双链DNA序列。即得到了目的基因。 反转录-聚合酶链反应法 (一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的mRNA 1, 细胞总RNA的提取 : 取胰岛B细胞，用PBS洗后，加入TRIZOL试将细胞破裂，后用DEPC处理，多次离心后，取RNA白色沉淀，测OD值，电泳。 2 ，从总RNA中分离mRNA： 取上述提取的总RNA若干，加入Buffer OBB ，Oligotex Suspension ，打匀。 70℃水浴（裂解RNA的二级结构）， 20-30℃条件下，静置（让Oligotex与mRNA结合）。 将Oligotex/mRNA复合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速离心，加Buffer将其他RNA洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。 （二）mRNA转录合成cDNA第一链 cone 第一链的合成 加入上步获得的mRNA和适当引物于EP管中，加入RNase-free water，混匀后,70℃反应10分钟，反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入缓冲液、 RNA酶抑制剂、反转录酶、 dNTP（加入放射性同位素利于检验）， ?混匀，稍微离心反应物之后,42 （三）PCR法扩增，特异合成目的cDNA链 通过胰岛素的特异引物，用PCR法进行扩增，特异的合成胰岛素的cDNA链 。 PCR法的操作步骤： 预变性 引物退火 引物延伸 循环25-35次 最后延伸 前端引物： 5’-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac cac cac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3’ 后端引物： 5’-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3’ 组建重组质粒 采用pQE--30质粒作为载体，用双酶切法进行基因重组。 １.双酶切法 　　用两种酶限制性内切核酸酸消化载体DNA和外源DNA片段，使载体和外源目的基因的两端分别形成不同黏性末端，将它们混合，在连接酶的作用下相同的黏性末端可退火连接成重组DNA分子，从而实现DNA的定向连接。 ２.重组过程 pQE--30用Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。外源DNA片段同样也用Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切并回收纯化酶切片段。双酶切后的载体外源DNA片段混合退火，因为Hind Ⅲ和BamHⅠ的黏性末端不匹配，避免了载体和外源DNA片段的自身连接，外源DNA片段只能定向地连接到载体的Hind Ⅲ和BamHⅠ位点之间。当然也不可避免发生载体的Hind Ⅲ和BamHⅠ的黏性末端之间的两个碱基互补形成开环，转到大肠杆菌中被修复，但这样的重组子占少数，是低效转化。 三、构建基因工程菌 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 A链和B链同时表达法 将人胰岛素的A链和B链编码序列拼接在一起，然后组装在大肠杆菌-半乳糖苷酶基因的下游。重组子表达出的融合蛋白经CNBr处理后，分离纯化A-B链多肽，然后再根据两条链连接处的氨基酸残基性质，采用相应的裂解方法获得A链和B链肽段，最终通过体外化学折叠制备具有活性的重组人胰岛素。重组DNA的转化 1, CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞： 取100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体，用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心，收集菌体，用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体 ，冰浴放置12 - 24小时，备用。 2，大肠杆菌感受态细胞的质粒转化： 取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组，DNA连接液，混匀。冰浴放置半小时 。在42 ℃保温 2 分钟（热脉冲），快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 – 2 分钟 。加入1 ml 新鲜培养基，于37 ℃培养 1 小时（扩增） 。涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。 经典的CaCl2转化方法： a将培养液转入 HYPERLINK /consumables/list.asp?sortid=7typeid=88 \t _blank 离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。　　b 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。 　　c弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻