实时荧光定量PCR数据分析与常见问题分析报告.pptVIP

实时荧光定量PCR数据分析及常见问题分析 一、数据分析 定量PCR扩增曲线的各种概念 一、数据分析 什么是基线 基线是扩增曲线的水平部分。 一、数据分析 基线扣除 一、数据分析 什么是阈值 阈值是一个荧光强度值，穿过阈值与X轴平行的直线称为阈值线。 一、数据分析 什么是Ct值 Ct值是阈值线与扩增曲线的交点对应在X轴上的值。 一、数据分析 基线 一、数据分析 基线 一、数据分析 基线 一、数据分析 基线 一、数据分析 阈值线 一、数据分析 阈值线 二、常见问题分析 1、PCR扩增抑制（以Bio-CFX96为例） 扩增曲线荧光强度大小及Ct值大小可提示存在抑制。 H07存在扩增抑制；解决方法：将样本稀释后进行扩增。 （抑制物的影响可通过稀释样本消除） 二、常见问题分析 PCR抑制物 黑色素 多糖类 血红蛋白 尿素 其他 乙醇 蛋白酶K 胍盐 苯酚 二、常见问题分析 血液中PCR抑制物的作用机制及对策 抑制物 作用原理 对策 肝素 可结合于DNA和RNA上； 对反转录酶和聚合酶有抑制作用。 肝素酶或氯化锂 血红蛋白 含有铁，释放铁离子至PCR混合物， 干扰DNA合成。 1）DNA-琼浆糖凝胶珠的相互混合； 2）加入0.6%（wt/vol）的BSA（牛血清白蛋白）； 3）NaOH处理。 乳铁蛋白 含有铁，释放铁离子至PCR混合物， 干扰DNA合成。 同上 免疫球蛋白IgG 与单链DNA相互作用 同上 亚铁血红素 与DNA、RNA结合，后续的提取过程中不能被去除； 抑制聚合酶活性。 加BSA，结合亚铁血红素 二、常见问题分析 检查样本质量 用分光光度计测量样本260/280比值 DNA纯度：OD260/OD280=1.8 RNA纯度：OD260/OD280=2.0 二、常见问题分析 2、自动基线有问题 二、常见问题分析 手动设置基线 点击右键，选择Baseline Threshold 二、常见问题分析 手动设置基线 将Baseline End设置为“扩增信号出现的前一个循环” 即，原始为26，将其设置为20，点击OK 二、常见问题分析 手动设置基线 设置完成后问题曲线恢复正常 二、常见问题分析 3、重复性 1个样本4个复孔重复性好 二、常见问题分析 3、重复性 1个样本4个复孔重复性差 二、常见问题分析 造成重复性差的原因 基线、阈值的设置 加样误差（操作？移液器？） 没有将试剂和样本充分混匀 低拷贝的样本→泊松分布 没有使用ROX校准（ABI7500） 二、常见问题分析 基线、阈值的设置 根据曲线的具体情况进行设置： 阈值：大部分曲线荧光强度/20 基线：开始→2/3（根据仪器和试剂） 结束→扩增信号出现的前一个循环 如果基线、阈值设置无问题，则是其它原因造成重复性差。 二、常见问题分析 加样误差（操作？移液器？） 没有将试剂和样本充分混匀 有时候在制备PCR反应混合液时（包括Goldstar/PCR Mix反应液、引物探针、样本、水），在分装入反应板（管）前没有充分混匀。 结果加入到每个孔中的试剂成分就有所不同。 解决方法： 在分装反应混合液前，要将其充分混匀（振荡、吹打）离心。 同时上机之前，要将PCR反应板（管）离心，使所有液体都在反应管底部。 二、常见问题分析 低拷贝的样本→泊松分布 泊松分布：是一种统计与概率学里常见到的离散机率分布（discrete probability distribution）。 在30ul中有9个模板，每个反应管均匀的分配到3个模板的几率有多高？如果30ul中有9000个模板呢，又会怎么样？ 二、常见问题分析 ROX校准：参比荧光（ABI7500） 二、常见问题分析 ROX设置 ABI7500仪器软件自动进行ROX校准。 ROX校准为可选步骤，如果使用的PCR试剂没有添加ROX参比荧光，或者ROX添加浓度不适合，请将ROX校准关闭（None）。 二、常见问题分析 4、“可疑的” 扩增曲线（以ABI7500为例） 由于PCR扩增形成的真正的扩增曲线通常很容易确认。 有特征的形状：首先有背景信号（基线期），然后是三个增长阶段（指数增长期、线性增长期和平台期） 二、常见问题分析 指数增长期内扩增曲线具有高度重复性 二、常见问题分析 是什么原因造成平台期很低呢？ 可能是目标样本的浓度太低。 通常如果模板的起始浓度太低，反应体系中会形成大量的引物二聚体。 大量引物二聚体的形成使得引物很快消耗完，从而造成扩增曲线的平台期很低。 二、常见问题分析 引物和模板比例 二、常见问题分析 是否可以调整引物和模板的比例？ YES。 低引物浓度会导致高Ct值（灵敏度低）。 所以对于低浓度的样本，反应体系中引物的浓度却不能太低