原核表达Arresten蛋白抑制血管生成作用-生物通.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，３１（１）：１９２３ ? 原核表达Ａｒｒｅｓｔｅｎ蛋白抑制血管生成作用 吕　懿　郑金平 （山西医科大学卫生毒理学教研室　太原　０３０００１） 摘要　目的：研究原核表达的Ａｒｒｅｓｔｅｎ蛋白纯化品对血管内皮细胞及血管生成的抑制作用。方 法：ＭＴＴ法检测 Ａｒｒｅｓｔｅｎ蛋白对人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）增殖的影响；流式细胞仪分析 Ａｒｒｅｓｔｅｎ蛋白作用下ＨＵＶＥＣ凋亡的情况；细胞迁移实验观察Ａｒｒｅｓｔｅｎ蛋白对ＨＵＶＥＣ迁移能力的 影响；鸡胚绒毛尿囊膜（ＣＡＭ）实验观察Ａｒｒｅｓｔｅｎ蛋白对新生血管的抑制情况。结果：原核表达的 Ａｒｒｅｓｔｅｎ蛋白纯化品能特异性地抑制 ＨＵＶＥＣ的增殖、迁移，诱导ＨＵＶＥＣ的凋亡，并在一定范围 内呈现出剂量—效应关系。Ａｒｒｅｓｔｅｎ蛋白能有效抑制鸡胚尿囊膜血管的生长（Ｐ＜０．０１）。结论： 原核表达的Ａｒｒｅｓｔｅｎ蛋白纯化品对内皮细胞有特异的抑制作用，能有效抑制血管生成。 关键词　Ａｒｒｅｓｔｅｎ　血管抑制因子　原核表达　血管生成 中图分类号　Ｑ７８６ ［１］ 　　Ａｒｒｅｓｔｅｎ是 Ｃｏｌｏｒａｄｏ等 ２０００年研究发现的一种 １．３　主要试剂 高效稳定的内源性血管生成抑制因子，是 型胶原 Ｉ 　　ＤＭＥＭ培养基为Ｇｉｂｃｏ公司产品，小牛血清为杭州 Ⅳ α 链羧基末端ＮＣＩ结构域多肽片段，其对应的ｍＲＮＡ编 四季青公司产品，胰酶为Ｌｉｆｅｔｅｃｈｏｎｌｉｇｉｅｓ．Ｉｎｃ产品，ＰＢＳ 码序列长６９０ｂｐ，肽链由２２９个氨基酸残基组成，等电 为Ｓｉｇｍａ公司产品，ＭＴＴ为Ａｍｒｅｓｃｏ分装产品，Ａｎｎｅｘｉｎ 点为６．４，相对分子质量 （Ｍｒ）为２６ｋＤａ。研究发现， ＶＦＩＴＣ／ＰＩ试剂盒为凯基公司产品。 Ａｒｒｅｓｔｅｎ能特异性阻滞实体瘤血管生成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）， ２　方　法 在肿瘤治疗方面显示出良好的应用前景。从细胞水平 ［２］ 探讨前期制备的原核表达Ａｒｒｅｓｔｅｎ蛋白纯化品 对内 ２．１　细胞的体外培养 皮细胞的抑制作用，并通过ＣＡＭ模型直观的验证其抑 ２ 　　人脐静脉内皮细胞ＨＵＶＥＣ接种于２５ｃｍ 细胞培 制血管生成效果，为Ａｒｒｅｓｔｅｎ蛋白的临床应用奠定实验 养瓶，置于３７℃，５％ ＣＯ 培养箱内培养。培养基为 ２ 基础。 ＤＭＥＭ，含１０％胎牛血清、１００Ｕ／ｍｌ青霉素和１００Ｕ／ｍｌ １　材料与试剂 链霉素。用０．２５％胰酶消化传代，每周传代２～３次。 ２．２　ＭＴＴ检测Ａｒｒｅｓｔｅｎ蛋白对ＨＵＶＥＣ增殖的影响 １．１　原核表达Ａｒｒｅｓｔｅｎ蛋白 ５ 　　按１×１０个／ｍｌ细胞密度分别接种于９６孔板，培 ［３］ 　　在先前研究中获得原核表达的Ａｒｒｅｓｔｅｎ蛋白 ，经 养至８０％融合，分成对照组及实验组，换液，对照组用 ［２］ 纯化获