膜片钳技术其应用2010.ppt

（2）通道调节能力缺陷：如细胞内钙在淋巴细胞的增殖、分化、IL-2的分泌及受体的表达等方面起作重要作用，淋巴细胞膜上K（Ca）通道对细胞内钙的调节起作重要作用，研究表明，K通道阻断剂阻断此通道后，淋巴细胞的分裂增殖及IL-2的合成明显受到抑制。K（Ca）开放引起大量K外流，使细胞膜超级化，对Ca离子内流的驱动力增大，使[Ca]i增加， [Ca]i又使K（Ca）通道活化，导致[Ca]i增加。 （3）产生自身抗体：如重症肌无力，是一种神经肌肉终板部位突触后膜上AChR减少而出现传递障碍的自身免疫性疾病，有家族史，与遗传密切相关。骨骼肌细胞AChR通道出现抗体，导致AChR功能障碍，以骨骼肌的渐进性疲劳和延及全身的虚弱为特点。 （4）形成新的离子通道而产生疾病：如B淀粉样蛋白可在神经元膜上形成大的非选择性离子通道，该通道可通透Ca离子，这可能是老年性痴呆疾病中神经原受损的原因之一。 药物筛选：美国FDA规定，有关抗心率失常药物的申报必须有膜片钳的相关实验数据，膜片钳已成为抗心率失常药物筛选的金标准。Ⅲ类抗心率失常药物的寻找是当前心血管药物研究的重要方向，其作用特点是抑制瞬时外向钾电流、内相整流钾电流等多种钾离子通道，使动作电位时程（APD）延长，减慢兴奋的传导，降低心肌细胞兴奋性，从而发挥短期抗心律失常作用。各种K通道被抑制均可使APD延长，要单独观察药物对某一种钾电流的作用，并与其他K电流的影响相区别，普通的电生理实验是难以实现的，在这方面膜片钳有其独特的优越性。 细胞的胞吐与胞吞功能测定：几乎所有细胞的脂质双层膜其电容均为1μF/cm2 ，因此通过测定膜电容可精确反映细胞表面积的变化。当分泌囊泡与细胞膜融合后，其囊泡膜会增加到细胞膜上而使细胞膜的表面积增大；而当分泌囊泡经胞饮作用从细胞膜上退出后，则会使细胞膜的表面积减少，因此通过对细胞膜电容的监测可以反映细胞的分泌活动及其机制，另外，膜融合产生的一过性电流也可记录到。 膜片钳在其他方面的应用：膜片钳技术是一个应用非常广泛的电生理技术，他不仅用来记录离子通道的电活动，膜片钳电极本身还有许多非电生理学方面的应用，他与其他生物学方法的结合应用目前已经非常普遍。 膜片钳和钙图像技术的联合应用：Ca2+是重要的信使物质，Ca2+ 的信使功能是通过调控细胞内游离Ca2+ 浓度来实现的。Ca2+ 信号的产生和终止是细胞内Ca2+ 增减、波动的结果。因此测定细胞溶质中的Ca2+ 浓度是十分重要的。 钙荧光指示剂法是目前应用最广泛的, 也是较好的测定胞内Ca2+ 浓度的方法。目前常用孵育法将荧光指示剂如Fura-2/AM导入细胞。因为荧光指示剂被酯化后, 很容易跨过质膜进入细胞内。在胞内, 酯形式指示剂被非特异性酯酶水解, 重新与Ca2+ 结合，在340nm～ 380nm 的荧光强度比值能够很好的反映Ca2+ 浓度。应用酯类的荧光物质负载进入细胞的方法尽管较为简便,但是,荧光染料会累积在胞内的酸性细胞器中(称为隔室效应) ,而不是与细胞胞浆内的游离Ca2 + 相结合,因此会导致测量上的误差,且这种方法不适用于植物细胞，因为植物细胞的质膜存在非特异性酯酶，导致指示剂未进入胞内即被水解，利用膜片钳的全细胞技术，可将荧光探针直接导入细胞，从而避免隔室效应，也可通过膜片钳电极将细胞内的荧光探针抽吸稀释掉，从而测定细胞器（线粒体，内质网等）内的游离钙离子浓度。将膜片钳和钙图像技术联合应用可在测定细胞内游离Ca2+离子浓度的同时检测离子通道的功能改变。 膜片钳和激光共聚焦的联合应用：前面介绍的膜片钳和钙图像技术的联合应用测定细胞内钙只适用于单个的细胞，而利用这种方法测定脑片上单一神经元的离子浓度比较困难，原因在于在脑片上一个神经元的胞体和树突不在一个聚焦平面上，影响测定浓度 ，激光共聚焦扫描显微镜大大减小了所测定细胞不同部位不在同一聚焦平面的误差，这对在脑片上细胞内离于浓度的测定更有意义 。同时对在脑片上进行细胞形态研究更显优势。 与分子生物学的结合：膜片钳技术与分子生物学技术的联合运用已经非常广泛，分子生物学技术为离子通道的亚单位分子结构研究、基因的克隆、通道的表达等研究提供了有力的手段。 通道、受体等的异源性表达：最常见的例子是通过向卵母细胞细胞内注射离子通道或受体的mRNA(或cDNA),使他们在卵母细胞中表达，然后研究其功能。或用基因突变技术改变氨基酸序列，改变蛋白质的性质，再用膜片钳研究其功能。 单细胞基因表达的分析：采用全细胞记录技术将mRNA从细胞中提出，对细胞的基因进行分析。它能对特定离子通道亚单位的mRNA与通道对电刺激、药物刺激所产生反应之间的关系进行研究。 膜片钳在检测神经递质释放中的应用：神经递质由突触前膜释放，并在突触传递中起作用。迄今为止，人们