DNA提取纯化检测.pptVIP

实验一 真核细胞染色体DNA的 分离、纯化和检测 实 验 目 的 通过实验学习从血液中制备染色体DNA的方法。 学习琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度、DNA的构型、含量以及分子量的大小。 掌握DNA样品的纯化和定量检测方法。 实 验 原 理 红细胞裂解液裂解红细胞 细胞裂解液裂解白细胞 用蛋白酶K水解蛋白质 有机溶剂酚、氯仿抽提 在高盐条件下，用乙醇沉淀DNA 再用70%乙醇洗除沉淀中的盐分 即可获得染色体DNA DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。前者由分子所带净电荷量的多少而定，后者则主要与分子大小及其构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，在用电泳法测定DNA分子大小时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定，提高分辨率。同时适当减低电泳时的电压，也可使分子筛效应相对增加而提高分辨率。 实 验 原 理 实 验 原 理 纯净的DNA A260/A280=1.8，制备的DNA样品应该为1.7~1.8 纯净的RNA A260/A280=2.0，制备的RNA样品应该大于2.0 如果制备的DNA样品A260/A2801.7，说明样品中含酶和蛋白质过高，应将样品用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA； A260/A2802，说明样品中RNA过高，可用RNase消化后，用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA； 如果样品A260/A280为1.8~2.0，说明样品中盐的含量过高，样品沉淀后应用70%乙醇多洗一遍。 提取的RNA样品A260/A280应大于1.80。RNA样品含有蛋白质会使A260/A280比值下降。 实 验 材 料 红细胞裂解液 KHCO3 1g (10mM) NH4Cl 8.3g (155mM) EDTA·Na2 37mg (0.1mM) 裂解缓冲液（lysis buffer） 10mM Tris-Cl (pH8.0) 0.1M EDTA (pH8.0) 0.5%(m/v) SDS ACD抗凝液 柠檬酸 0.48g 柠檬酸钠 1.32g 右旋葡萄糖 1.47g 加水至100ml,使用时每6ml新鲜血液加1ml ACD液 组织细胞 动物血液样品，将20ml新鲜血液与3.5mlACD抗凝液混匀，0℃下保存数天或-70℃下长期冻存，备用。 实 验 材 料 酚：氯仿：异戊醇（25：4：1） 70%乙醇 TE buffer RNAse 琼脂糖 TAE电泳缓冲液 电泳设备 紫外分光光度计 凝胶成像系统 染色体DNA的制备方法 1. 将800ul抗凝储冻血液置室温溶解。 2. 往管中加2ml红细胞裂解液，轻摇数次，置冰上15分钟，期间间歇摇动 几次，看管底沉淀，悬浮沉淀。 3. 6000rpm，室温离心10分钟，弃上清。 4. 往管中加入4ml红细胞裂解液，轻摇几次后，冰上5分钟，期间摇几次， 看管底沉淀，摇动试管悬浮沉淀。 5. 6000rpm，4℃离心5分钟，弃上清。 6. 重复步骤4、5，1-2遍（视红细胞洗净程度而定），至沉淀白色。 7. 用1×PBS 4ml洗涤所得沉淀，混匀，冰上5分钟，期间摇动几次。 8. 6000rpm，4℃离心5~10分钟，弃上清。 9. 每管中加入500μl白细胞裂解缓冲液，重悬细胞，加入20μl proteinase K（20mg/ml），混匀后置55℃水浴1小时，至溶液清亮（澄清）。 染色体DNA的制备方法 10. 用酚-氯仿（350μl+350μl）、氯仿（450μl）分别抽提一次，每次抽提后10000rpm，4℃离心5分钟，取上清（不要吸入有机相）。 11. 上清中加入2倍冰预冷无水乙醇和0.1倍3M NaAc。冰上20分钟或-20℃过夜。 12. 12000rpm，4℃离心10分钟，弃上清。 13. 用1ml 70%乙醇洗涤沉淀1-2次，12000rpm，4℃离心5分钟，弃上清。 14. 室温干燥沉淀5分钟。 15. 加入100μl DDW（无菌水），37℃水浴至DNA溶解。 16. 取样品10μl，用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定样品。 17. 相对完整的染色体DNA在电泳图中只出现一条分子量较大的条带，不会出现条带弥散现象。 18. 取样品10μl，稀释100倍，测A260和A280，