06 融合蛋白表达载体构建的设计与质粒提取与分析.pptVIP

限制性核酸内切酶 主要来源于原核生物，具有识别自身DNA或异源DNA的功能，通过切割破坏或限制异源DNA分子侵入宿主细胞来保护自身。 识别特性：具有双链对称的回文结构 ↓ 5’ – G A A T T C - 3’ 3’ – C T T A A G - 5’ ↑ 限制性核酸内切酶 命名：H in d III 属 种 株 同一株具不同特异性酶 分类：根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修饰酶活性，可分为Ⅰ型、 Ⅱ型和Ⅲ型三类。DNA重组技术中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。 同裂酶（异源同功酶）：来源不同，识别的是同样的核苷酸靶子序列。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。 同尾酶：来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相同的粘性末端。 BamHⅠ、BclⅠ、 BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。 BamHⅠ： BglⅡ： 目的基因 cDNA：complementary DNA 经反转录合成的、与RNA互补的单链DNA。 基因组DNA： 代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。 目前获取目的基因的几种途径或来源 化学合成法 用适当方法筛选cDNA或gDNA文库就可以分离到目的基因。 RT-PCR(从mRNA合成cDNA ) 从染色体DNA中分离 载体 载体的分类 按来源：质粒、噬菌体、病毒 按产物：克隆载体、表达载体 按宿主细胞：原核细胞载体、真核细胞载体 供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。功能：1.运送外源基因高效转入受体细胞； 2.为外源基因提供复制能力或整合能力；3.为外源基因的扩增或表达提供条件。 载体具备条件 1.自主稳定复制 2.多克隆位点 3.遗传标记 4.分子量小，插入容量大 5. 细胞内拷贝多 6.安全 1. 细菌质粒 是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。最常用的质粒是pBR322。 2. 噬菌体（phage） 噬菌体是感染细菌的病毒，按其生活周期分为溶菌型及溶原型两型。用野生型λ噬菌体改造和构建的噬菌体载体是线性双链DNA，基因组约为50kb，最常用的哓菌体为λDNA及其衍生系列。 3. 黏性质粒（cosmid） 是由质粒与噬菌体λDNA组成的一种4-6kb的环状杂种DNA。 表达型载体 将上述细菌质粒载体或噬菌体载体接上启动基因及多聚核糖体的基因序列组成了表达型载体。 不同类型载体容量 质粒pUC19的分子结构 ① ② ③ ④ 重组DNA技术的基本流程 1. 目的基因的获取 2. 克隆载体的选择与构建 3. 外源基因与载体的连接 4. 重组DNA导入受体菌 5. 重组体的筛选 6. 克隆基因的表达 实验流程 Part IV： 蛋白表达载体的构建 克隆基因的表达体系 　　1．原核表达体系 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。 大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点： 易于生长和控制； 用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵； 有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。 操作方便、快捷，需时较短，表达量大， 适合工业化生产 大肠杆菌表达体系中尚有一些不足之处： ①由于缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组DNA ② 由于缺乏适当的翻译后加工机制，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进 行糖基化修饰 ③ 表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处理 ④ 很难表达大量的可溶性蛋白。 　 克隆基因的表达体系 2．真核表达体系 　与原核表达体系比较，真核表达体系如酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优势性。尤其是哺乳类动物细胞，不仅可表达真核的cDNA，而且还可表达真核基因组DNA