试验六发酵液中DBT含量的测定.PDF

发酵液中DBT含量的测定 李国强魏东盛 邓飞 一、实验目的  (1) 确定DBT的降解程度。  (2) 了解高效液相色谱(HPLC)的原理及使 用方法。  (3) 掌握用HPLC测定发酵液中DBT含量的 方法。 二、实验原理 二、实验原理 1 HPLC的种类 1 HPLC的种类 正相色谱 (NP-HPLC) 反相色谱 (RP-HPLC) 离子交换色谱 (IEC) 空间排阻色谱 (SEC) 液相色谱按两相极性不同分类 正相色谱 反相色谱 化合物保留时间随流动相配比的变化 不同极性的化合物出峰顺序不同 正相HPLC 色谱柱  硅胶型  氰基型  氨基型 糖类分析  二醇基型 蛋白质分析 -Si-CH2CH2CH2CN -Si-CH2CH2CH2NH2 Si -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH) Si Silica gel Modified Si 反相HPLC 色谱柱 C18 (ODS) type C8 (octyl) type Non-polar property Non-polar property C4 (butyl) type -Si-C H  Phenyl type 18 37 TMS type Si Cyano type  反向色谱 : 反向色谱用的填料常是以硅胶为基质， 表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。适用于 能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物样品  反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、甲 醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极 性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在 色谱柱上有更强的保留。 三、实验材料 实验药品： DBT、甲醇（色谱纯）、超纯水。 (2) 实验仪器： 1100高效液相色谱仪（Agilent公司）、微孔滤膜(0.45 μm)。 色谱条件： 色谱柱：C18 （4.6 ×250mm，5 μm）； 检测器：紫外检测器； 检测波长：244nm； 柱温：室温； 进样量：20 μL； 流速：1mL/min； 流动相：甲醇∶水=9 ∶1； 根据保留时间定性，峰面积定量。 四、实验步骤 1、标准曲线的绘制 a. 称取2.0mg DBT，置于50mL容量瓶内用 乙酸乙酯定容至20mL，即DBT母液浓度为 40mg/L （老师）； b. 按照下表将DBT母液用乙酸乙酯稀释成不同 梯度，在7个20mL的试管内按照下表配制 （老师）: 将各管摇匀，每支试管取20 μL进样，按实 验材料中的色谱条件进行分析。记录1~7号 管的峰面积。以峰面积为纵坐标，DBT浓度 (mg/L)为横坐标绘出标准曲线 （学生操 作）。 2 发酵液中DBT的定量分析 取0.5mL 0和48 h 发酵罐培养液及工程菌 株和新的原始菌株的摇瓶发酵液，于1.5 mL离心管中立即以等体积的乙酸乙酯抽提 发酵液，漩涡震荡15s充分混匀， 10000r/min离心5min。上层有机相取 20 μL进样，按实验材料中的色谱条件进行 分析。每个样品做两个平行，测得峰面积后 取平均