T细胞转染实验.docxVIP

T细胞转染 一、前言： 原代 T 细胞的常用病毒有两种： 1. 逆转录病毒（mTRv 和 hRv） 2. 悬浮细胞专用的腺病毒（Ads） 逆转录病毒感染细胞具有物种特异性，适用小鼠原代 T 细胞的为 mTRv，适用人原代 T 细胞的为 hTRv。逆转录病毒可以用来构建稳转系。 专用腺病毒 Ads 不区分物种，对人、小鼠等物种的原代 T 细胞均具有很高的感染效率，另外，Ads 也非常适用感染其他悬浮细胞，如 Jurkat，K562，HL-60 和 L1210 等。 细胞转染主要分三个步骤：细胞制备、细胞体外刺激、细胞感染。 二、细胞制备： 小鼠脾脏细胞悬液制备 1. 脱颈处死小鼠，腹部朝上正体位暴露小鼠右侧腹部。 2. 75％ 乙醇消毒，剪开腹部切取脾脏。 3. 将脾脏放入预先放置好 cell strainer（FALCON，352350）并已加入 5 ml 无菌 PBS 的六孔板或培养皿中。 4. 用无菌注射器柄充分研磨脾脏。 5. 弃掉 cell strainer，轻柔吹打细胞至充分重悬，收集到一无菌 15 ml 离心管中，于 4℃ 400 g，离心 5 min。 注：一旦取出脾脏，请置于冰上操作。 6. 将第 5 步离心后弃上清的脾脏细胞用 5 ml 无菌 ACK 裂解液轻柔充分吹打混匀，于冰上裂解 5 min。 注：ACK 裂解液配方如下表，配好之后用 0.22 μm 的滤膜过滤，4℃ 保存不超过 1 月。 7. 裂解结束后加入 10 ml 无菌 PBS 终止裂解反应，于 4℃ 400 g 离心 5 min。 8. 弃上清，用 10 ml 无菌 PBS 洗一次，弃上清后直接加入培养基重悬计数，一只脾脏可得 3-10x107 个细胞。 注：如果要进行下一步的分离 CD4+T 细胞操作，请直接按照说明书将细胞重悬在合适体积的 PBS 中。 人 PBMC 细胞制备 1.取一 15 ml 离心管，加入 2 ml 已用抗凝剂处理过的人血液样品，再加入等体积的 PBS 进行稀释（终体积 4 ml）。 注：若为经过处理的浓缩血液样品，请按照新的稀释倍数合理稀释。为了保证分离细胞的活力和效率，请使用新鲜血液，血液样品请于 18～20℃ 保存。 2.上下颠倒或用枪混匀样品，备用。 3.上下翻转确保 Ficoll-Paque PLUS (GE) 分离液彻底混匀，去掉聚丙烯瓶盖，使用注射器针头插入瓶塞吸取 3 ml 分离液。 注：分离之前请将 Ficoll-Paque PLUS 分离液预热至 18～20℃。 4.取一新的无菌 15 ml 离心管，加入 3 ml 步骤 3 中取出的分离液。 5.小心加入稀释好的 4 ml 血液样品，不要打破 Ficoll-Paque PLUS 液面。 注：可将离心管倾斜至与水平台面呈 30°，缓慢沿管壁加入血液样品。 6．将离心管小心竖直放入离心机内，于 18～20℃，400 g 离心 30～40 min。 注：特别注意将离心机的降速加速度调到 0。 7.小心取出离心管。此时液体分为 3 层，中层为分离液层，最下层为红细胞，最上层为血浆。位于中层靠近血浆层的白膜层即为单个核细胞层，小心吸走血浆层，不要打动白膜层。 注：可吸出最上层的血浆层保存以备后续使用。 8.用无菌移液枪将白膜吸到一新的离心管中。 9.用三倍体积（约 6 ml）的无菌 PBS 重悬步骤 7 中的 PBMC，重悬时用枪轻柔吹散，于 18～20℃，400 g 离心 10～15 min，重复一次，最后用培养基重悬备用，多余的 PBMC 可以冻存继续使用。 特注：在较高的离心速度下（400～500 g）可以提高 PBMC 的得率，同时需注意在较低的离心速度下（60～100 g）可以分离掉不需要的血小板。另外如上操作和比例适用于更大体积的分离。 三、细胞体外刺激： CD4+ T 细胞体外刺激 1. 按照小鼠或人源 CD4+ T 细胞分离 kit (Thermo) 说明书分离得到 CD4+ T 细胞。 2. 取所需体积的 PBS，按照 5 μg/ml 的终浓度加入 Anti-mouse CD3e 和 Anti-mouse CD28 抗体，500 μl/孔包被 Non-Treated 24-well plate，室温放置 4 h，吸掉抗体悬液，加入 500 μl 1% BSA（PBS 配置）室温封闭 30 min，封闭结束加入 500 μl PBS 洗孔一次。 注：请在分离细胞的同时准备好平板，包括后续感染所需的量。 3．将分离得到的 CD4+ T 按照浓度 5x105 cell/ml 重悬在完全 T 细胞培养基中（1640，10% FBS，1% penicillin-streptomycin， 50 μM β-mercaptoethanol, 100