龙眼己糖激酶基因的克隆及原核表达-华南农业大学学报.PDF

　华南农业大学学报　２０１５，３６（３）：９１９７ ｈｔｔｐ： ｘｕｅｂａｏ．ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ∥ 　　　　　　　　　　 　ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｄｏｉ：１０．７６７１／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１４１１Ｘ．２０１５．０３．０１６　 帅　良，李　静，韩冬梅，等．龙眼己糖激酶基因的克隆及原核表达［Ｊ］．华南农业大学学报，２０１５，３６（３）：９１９７． 龙眼己糖激酶基因的克隆及原核表达 １ １ ２ １ 帅　良，李　静 ，韩冬梅 ，吴振先 （１华南农业大学 园艺学院，广东广州５１０６４２；２广东省农业科学院果树研究所，广东广州５１０６４０） 摘要：【目的】克隆龙眼Ｄｉｍｏｃａｒｐｕｓｌｏｎｇａｎ己糖激酶（Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ，ＨＸＫ）基因，并对其进行生物信息学分析及原核表 达分析．【方法】以龙眼总ＲＮＡ为模板，采用ＲＴＰＣＲ结合ＲＡＣＥ法获得基因全长ｃＤＮＡ序列，构建ｐＥＴ３２ａＤｌＨＸＫ 原核表达载体，转化到大肠埃希菌ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）中诱导表达．【结果和结论】成功克隆龙眼己糖激酶 基因的ｃＤＮＡ全长序列，命名为ＤｌＨＸＫ，登录号为ＫＦ７７６９０６．１．龙眼ＤｌＨＸＫ序列全长２１０１ｂｐ，包括 １个 １４８８ｂｐ 的开放阅读框，预测编码４９５个氨基酸；进化树和相似性分析发现，该基因与温州蜜柑 Ｃｉｔｒｕｓｕｎｓｈｉｕ的相似性最高， 达到了８２％；荧光定量表达分析表明，ＤｌＨＸＫ基因随着果实的发育成熟表达量逐渐上升；经 ＩＰＴＧ诱导和 ＳＤＳ ＰＡＧＥ检测，所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白大小相吻合．由此可见，利用 ＲＴＰＣＲ结合 ＲＡＣＥ 方法成功克隆了龙眼的己糖激酶基因，构建原核表达载体，并在大肠埃希菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）中获得高效表达． 关键词：龙眼；己糖激酶；基因克隆；荧光定量ＰＣＲ；原核表达 中图分类号：Ｓ６６７．２　　　　　　文献标志码：Ａ　　　　　文章编号：１００１４１１Ｘ（２０１５）０３００９１０７ ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｅｘｏｋｉｎａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍＤｉｍｏｃａｒｐｕｓｌｏｎｇａｎ １ １ ２ １ ＳＨＵＡＩＬｉａｎｇ，ＬＩＪｉｎｇ，ＨＡＮＤｏｎｇｍｅｉ，ＷＵＺｈｅｎｘｉａｎ （１ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６４２，Ｃｈｉｎａ； ２ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｒｕｉｔＴｒｅｅＲｅｓｅａｒｃｈ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６４０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅｇｅｎｅ（ｎａｍｅｄＤｌＨＸＫ）ｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍｌｏｎｇａｎ，Ｄｉｍｏｃａｒｐｕｓｌｏｎｇａｎｃｖ． Ｓｈｉｘｉａ，ｆｒｕｉｔ．ＴｈｅｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎｄｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＤｌＨＸＫｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｔｏｔａｌ ＲＮＡｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｌｏｎｇａｎｆｒｕｉｔｗａｓｕｓｅｄａｓａｔｅｍｐｌａｔｅ．ＴｈｅｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆｔｈｅｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｕ ｓｉｎｇａｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＲＴＰＣＲａｎｄＲＡＣＥＰＣＲ．ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ３２ａ