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市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放 美丽的风车之国-荷兰 美丽的风车之国-荷兰 传统培养型环境微生物检测方法与改进 环境科学与工程系 马 放 主要内容 环境微生物的快速分离与计数 环境微生物的培养改良 环境微生物的保存与复壮 环境微生物生物量的测定 传统培养方法和非培养检测方法整合 环境微生物的快速分离与计数 环境微生物的快速分离与计数 微生物纯培养的确定：不同的微生物培养在固体、液体或半固体培养基中，微生物自身的群体形态和它的生长繁殖情况都不一样，表现出一定的培养特征和生长规律。 联苯好氧降解菌株的分离与鉴定 环境微生物的培养改良 培养基的设计及优化 培养基的设计及优化 培养基的设计及优化 培养基成分选择的原则 培养基配方的优化 环境微生物的培养改良 环境微生物的保藏与复壮 液体石蜡法 悬液法 干燥法：普通干燥法 冷冻真空干燥法 L-干燥法 冷冻法 菌龄：菌种保藏使用处于生长对数期后期或稳定期早期 的细胞为宜 细胞密度：细菌一般在108-109个/mL 保存方法：一般采用-70oC低温保藏法和液氮保藏法效 果较好 保护剂：甘油是细菌冷冻保藏中常用的一种保护剂 降温速率与复温速率：采用分段降温速率 复温时采用快速融化 传统培养方法和非培养检测方法整合 随着研究的不断进行，微生物纯培养技术暴露出巨大的局限性——平板计数异常，即环境中微生物实际数量同平板菌落计数之间存在巨大差异。 传统培养方法和非培养检测方法整合 传统培养方法和非培养方法有机结合的策略： 第一步，利用非培养技术在DNA水平上研究微生物在环境 中的功能、分布和变化情况 第二步，根据非培养方法的结果，改进纯培养的培养方 法，试图培养出尽可能多的微生物类群 传统培养方法和非培养检测方法整合 筛选方法 确定目的菌株、纯化并保存 偶氮染料脱色活性及耐盐性检测 反复平板稀释涂布分离 高盐条件下脱色偶氮染料的混合培养物 利用含一定浓度偶氮染料的高盐培养基驯化 土 壤 样 品 偶氮染料 菌株TL 耐盐偶氮染料脱色菌株的分离与鉴定 菌株TL的菌落形态 (a) 和细胞形态 (b) (a) (b) 形态观察 耐盐偶氮染料脱色菌株的分离与鉴定 菌株TL的生理生化特性 生长 4%NaCl生长 + 水解纤维素 – 产吲哚 – 氧化酶 – 脲酶 + 接触酶 + 葡萄糖产酸 橙色 细胞颜色 – 4℃生长 兼性厌氧 与氧的关系 + 41℃生长 无 鞭毛 + 硝酸盐还原 短杆状 细胞形状 – 水解DNA 阳性 革兰氏染色 结 果 试验项目 结 果 试验项目 注：+，阳性；–，阴性 菌株TL抗性实验结果 – 四环素（Ter） + 链霉素（Str） + 卡那霉素（Kan） – 氯霉素（Chl） + 氨苄青霉素（Amp） 实验结果 抗生素名称 注：+，有抗性；–，无抗性 耐盐偶氮染料脱色菌株的分离与鉴定 2,000 bp 1,000 bp M：DNA Marker DL2000 1：菌株TL的16S rDNA PCR扩增产物 2：正对照 3：负对照 菌株TL的16S rDNA PCR扩增产物 (a) 及其序列分析结果 (b) (a) (b) 耐盐偶氮染料脱色菌株的分离与鉴定 菌株TL的系统进化树 耐盐偶氮染料脱色菌株的分离与鉴定 筛选得到一株能够在厌氧、高盐环境中以蛋白胨为碳源和能源生长并脱色活性艳红X-3B的菌株，命名为TL。 菌株TL的菌落边缘不整齐，呈淡黄色，不易挑起；细胞为短杆状，无鞭毛，大小约为1.2 μm × 0.5 μm。 经形态观察、生理生化和16S rDNA分子鉴定，确定菌株TL属于微小杆菌属（Exiguobacterium）的菌株，是具有耐盐、还原偶氮化合物能力的新菌株。 菌株TL的16S rDNA全序列登录GenBank数据库，序列号为EU159578。 耐盐偶氮染料脱色菌株的分离与鉴定 环境微生物的培养改良所涉及的内容 培养基的优化 微生物生长的最适温度 微生物生长所需的氧气 微生物生长的最佳pH值 培养基设计及优化步骤 根据前人的经验和确定培养基成分时必须考虑的问题 来初步确定可能的培养基成分 通过单因子实验最终确定最为适宜的培养基成分 采用一些合理的实验设计方法对培养基 各成分之间配比（复配）进行优化，确定最适浓度。