第四章蛋白质与酶的化学修饰.pptx

第四章 蛋白质与酶的化学修饰;4.1、概述;一、限制酶的应用的原因 ;二、改变酶特性有两种主要的方法;三、酶化学修饰的概念;四、酶化学修饰的目的; 五、酶化学修饰的原理;;;;4.2、化学修饰的设计; ;;;三、反应条件的选择 修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。 （1）pH与离子强度 pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。 （2）修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。 （3）反应体系中酶与修饰剂的比例;四、化学修饰的影响因素;一）、蛋白质功能基反应性的影响因素;二）、蛋白质功能基的超反应性;;三）、修饰剂反应性的决定因素;;4.3、化学修饰的种类;一、表面修饰;1、化学固定化;2.小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰） 定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。 侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。 侧链基团修饰剂：采用各种小分子化合物。 20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。;几种重要的修饰反应： 烷基化反应 酰化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应; 1) 烷基化反应 试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。 可作用基团： 氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。 修饰剂：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。 ;烷基化反应; 2) 酰基化反应 试剂特点： 含有 结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。 可作用基团： 氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟基（Tyr）;酰基化反应; 3) 氧化和还原反应 试剂特点：具有氧化性或还原性。 氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺 可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。 还原剂：2－巯基乙醇、DTT等。 可被还原的侧链基团：二硫键。;连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。; 4) 芳香环取代反应 试剂：卤（碘）化，硝化试剂。 碘代： I2＋ ? + HI 硝化： (NO2)4C + ? +(NO2)3CH??; ; ;乙酸酐; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ;;氨基酸; ;10 ）、亲和修饰; ; ; ;3.大分子修饰（大分子结合修饰）;;;;大分子修饰(共价)的过程;1）聚乙二醇及其修饰反应 ;;修饰反应;;2）糖类的修饰反应 ; 4、肽链交联;; ;;;二、内部修饰;1、酶蛋白主链修饰;酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种： 1 、引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。 2、 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。 3 、有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。 后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称肽链有限水解。 ;2、催化基团的修饰 ;3、肽链伸展后的修饰 ;三、与辅因子相关的修饰 ;3、金属离子置换修饰Metal ion substitute modification;;;;四、物理修饰 ;物理修饰的效果 改变底物特异性 例：羧肽酶 ? 经高压处理，其水解能力降低，而有利于催化肽的合成反应（逆反应） 改变酶催化的最适温度 例：纤维素酶经高压处理，最适温度下降，但在 30～40 oC 条件下，活力提高了 10% 提高酶的稳定性 例：用盐酸胍破坏胰蛋白酶的空间构象，伸展肽链，再透析除去盐酸胍，在不同温度下重新构建 / 恢复酶的构象，50 oC 下重新构建的酶稳定性比天然酶提高 5 倍;;1、增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂与酶形成多点交联，一般能增强酶的热稳定性，可能的原因是多点交联产生固定酶分子构象的效应 PEG 修饰酶在热稳定性上没有明显提高，可能由于 PEG 和酶是单点交联 酶分子内基团间相互作用在受热情况下发生了变化，向热力学上熵增加的方向变化，即从紧密有序趋于随机松散。通过修饰后，使酶天然构象产生“刚性”，不易伸展打开，减小热振动，从而增强酶的热稳定性;2、保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶