RNA_SEQ原理与应用解析.ppt

RNA-seq技术原理及应用 报告人：柳晓东 2012.4.16 1、RNA-seq技术简介 2、RNA-seq技术原理 3、RNA-seq技术优势 4、RNA-seq技术应用 5、RNA-seq发展前景 一、RNA-seq技术简介 RNA-Seq(RNA sequencing)， 即 RNA测序又称转录组测序，就是把 mRNA，smallRNA和 non-coding RNA （ncRNA）全部或者其中一些用高通量测序技术进行测序分析的技术。 转录组的含义： 转录组是指特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的总和, 主要包括mRNA和非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)。 转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，是解读基因组功能原件和揭示细胞及组织分子组成所必需的。 有关ncRNA的一些知识： 非编码RNA(ncRNA)主要包括有以下几种：转运RNA(tRNA)， 核糖体RNA(rRNA)，小核RNA(snRNA)，核仁小分子RNA(snoRNA)，细胞质小分子RNA(scRNA)，不均一核RNA(hnRNA)及小RNA (microRNA,miRNA)等。 非编码RNA具有调节基因表达的作用，如对染色体结构的影响，对RNA加工修饰及稳定性的影响，对转录和翻译的影响，甚至对蛋白质的转运及稳定性都有一定的影响。 所以近年来，许多通过RNA-seq进行测序分析的文章都包括对ncRNA的分析，并且发现了许多新的ncRNA。 二、RNA-seq技术原理 RNA-seq 实验流程图 首先，我们获得细胞总RNA，然后根据实 验需要，比如是需要测mRNA，ncRNA还是 smallRNA等，对RNA样品进行处理。处理 好的RNA再进行片段化，然后反转录形成 cDNA，获得cDNA文库，然后在cDNA片段的 两端接上接头，最后用新一代高通量测序 依进行测序。 高通量测序 高通量测序技术（High-throughput sequencing）是指能够一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，每一次序列测定的读长一般较短的测序技术。 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。 三种高通量测序简介： 自2005年以来,以 Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的新一代测序技术相继诞生。之后Helicos Biosciences公司又推出单分子测序(Single molecule sequencing, SMS)技术。 三种高通量测序技术的优缺点 高通量测序中重要名词解释 1、测序深度：测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。假设一个基因组大小为7M，测序总碱基数为70M，则测序深度为10×。 2、覆盖度：测序获得的序列占整个基因组的比例。由于基因组中高GC含量，重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接组装的序列往往无法覆盖所有的区域，这些区域就叫做Gap。 二者的关系：测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系，测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降。当测序深度在10～15X以上时，基因组覆盖度和测序错误率控制均得以保证。 3、RPKM（reads per kilobase per million reads）是每百万读段中来自于某基因每千碱基长度的读段数。其公式为: 其中，total exon reads指映射到某个基因上的reads数，mapped reads指map到所有基因的总的reads数。 RPKM不仅对测序深度作了归一化，而且对基因长度也作了归一化，使得不同长度的基因在不同测序深度下得到的基因表达水平估计值具有了可比性，是目前最常用的基因表达估计方法。 三、RNA-seq技术优势 相对于传统的sanger测序法，RNA-seq具有以下优势： 1、数字化信号：直接测定每个转录本片段序列，单核苷酸分辨率的精确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。 2、高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。 3、任意物种的全基因组分析：无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析。同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并精确地识别可变剪切位点及cSNP，UTR区域。 SAGE, serial analysis of