生物分子高效分离与表征研究组.docVIP

国家重点基础研究发展计划（重大科学研究计划）课题年度报告 项目编号：2012CB910600 项目名称：蛋白质定量新方法及相关技术研究 课题编号：2012CB910604 课题名称：集成化蛋白质组定量分析系统 20 年度计划执行情况 年度计划完成情况 按照项目任务书要求，本课题在2012年度主要针对集成化蛋白质组定量分析系统，侧重开展了低残留蛋白质传质膜材料、缓冲溶液置换接口、亲水性酶解反应器等方面的研究工作，另外还开展了在线固相标记、集成化蛋白质定性和定量技术以及超高灵敏度蛋白质定量分析技术和系统的初步研究工作。按项目任务书的规定，完成了研究内容和预期目标。 在低残留蛋白质传质膜材料方面：发展了一种中空纤维膜的制备方法，该膜对蛋白质的回收率可达到95%； 在缓冲溶液置换接口方面：制备了一种基于中空纤维膜的缓冲溶液置换接口，接口对蛋白质的回收率可达到94%，可用于进一步蛋白质的定量分析； 在酶解反应器方面：1）制备了基于聚合物微球基质的亲水性微酶解反应器（IMER），该酶解反应器亲水性好、酶解速率快等特点，能够在1.5 min完成酵母提取蛋白的酶解，共鉴定到271个蛋白group；2）制备了基于磁性氧化石墨烯基质的亲水性IMER，结合微波辅助，可在15 s完成标准蛋白质的酶解，5 min完成鼠肝蛋白酶解，鉴定到456个蛋白group；3）制备了基于聚乙烯乙二胺修饰的聚丙烯酰胺整体材料的可再生型亲水性IMER，可在30 min内完成再生，在80 s内完成对大肠杆菌提取蛋白的酶解，鉴定到333个蛋白质；4）建立一种集蛋白质酶解、糖基化肽段富集以及去糖基化三个过程为一体的微反应系统，降低了样品损失，对蛋白质灵敏度比传统方法提高了5倍； 在固相标记技术方面：1）发展了磷酸肽富集-在线标记分析系统，实现了磷酸肽的富集及原位同位素标记，可从0.1 ?L血清中成功检测到4个磷酸肽；2）建立了在肼微球上固相富集和二甲基标记糖肽的一体化定量分析技术，将其用于人正常和癌症血清的糖蛋白差异化研究，发现galectin-3 binding protein可以作为潜在的临床肿瘤标记物；3）发展了一种双通道固相萃取标记系统，可实现蛋白质的变性、还原、烷基化、酶解和同位素标记以及除盐等过程，应用于高/低转移细胞株蛋白提取物分析， 在集成化蛋白质分析平台方面：1）构建了集成化蛋白质定量分析系统，实现了蛋白质酶解、在线标记、肽段分离以及质谱检测的集成化，可从10万个细胞中定量到约1700个蛋白质；2）构建了基于反相色谱-溶剂置换接口-固定化酶反应器-反相色谱-质谱的集成化蛋白质组分析平台，可将复杂蛋白质体系蛋白质鉴定数量提高10%左右，分析时间缩短1倍；3）建立了离子交换色谱-在线酶解-反相色谱-质谱的集成化蛋白质定量分析系统，该系统的定量RSD值为19.63%，用于小鼠腹水型肝癌淋巴道高/低转移细胞系蛋白质提取物分析，发现7种蛋白质在低转移细胞中高表达， 9种蛋白质在高转移细胞中高表达； 在超高灵敏度蛋白质定量分析技术和系统方面：1）发展了一种基于色谱绝对定量的蛋白质组学新方法，该方法对标准蛋白最低定量检测限为0.34 amol，相对偏差RSD1.58%，动态范围1-105；2）构建了二维阵列液相色谱高丰度蛋白去除系统，提高了样品预处理的自动化程度和通量。 此外，发展了一种细胞表面捕集新方法，可以通过同时分析糖蛋白的糖肽和非糖肽来实现蛋白质组样品准确定量分析。应用到两种人类细胞系Chang Liver和HepG2细胞表面糖蛋白的鉴定和定量中，发现33个糖蛋白在两个细胞系间的表达具有显著差异性，并对其中2种蛋白质进行了验证。 发表SCI论文7篇，申请发明专利2项，培养博士后1名，博士研究生3名。 研究工作的主要进展 2.1 中空纤维膜的制备 将锥形枪头（枪头出口端内径为450μm）垂直固定在一铁夹中。用注射器吸取一定量的聚砜浆料注满枪头。取一段毛细管垂直正中插入枪头的浆料内并穿过枪头的出口端，再将毛细管上端垂直固定在一环内，并在毛细管的下端悬挂一重物。在枪头的正下方放置一杯纯净的去离子水，然后松开毛细管上端的环，毛细管在重物的重力作用下自由落入盛水烧杯中，2 min后将毛细管从水中取出。毛细管在下落的过程中管壁外表面均匀粘附一层聚砜，聚砜遇水即刻水解成膜。将毛细管从成形的膜中抽取出来便可得到一中空纤维膜，膜内径即为毛细管的外径，膜外径即为枪头出口端内径。利用该中空纤维膜制备了一种在线除盐接口，可将溶液中的盐浓度降低2个数量级，同时以肌红蛋白为例，对该膜接口的非特异性吸附进行了考察，该膜接口对蛋白质的回收率可达95%。 2.2 缓冲溶液置换接口 在集成化蛋白质分析平台中，各维之间溶剂的兼容性是实现在线分离的关键因素之一。因此，利用溶剂置换接口来进行溶剂交换是解