免疫细胞的分离与检测.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 细胞凋亡 二、细胞凋亡的检测方法 1、形态观察法：凋亡的细胞皱缩，质膜完整，胞浆致密，细胞器密集，不同程度退变；核染色质致密，形成形状不一，大小不等的团块边集于核膜处，进而胞核裂解；胞浆发生芽突。胞浆芽突脱落后，形成许多凋亡小体。 2、生化检测法： ①胞浆内Ca2+浓度升高。②细胞内活性氧增多。③质膜通透性增高。④DNA内切酶被激活，双链DNA在核小体之间切断形成180~200bp的特征性的有序片段。⑤Ⅱ型谷氨酰胺转移酶和钙蛋白酶（Calpain）活性升高。 3、流式细胞仪检测法 1、形态观察法 （1）普通光镜检测 HE染色 甲基绿-派诺宁染色：细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程，需要有细胞内蛋白酶的激活，细胞质内常有mRNA表达的增强。而细胞坏死是一种被动的细胞死亡过程，细胞质内常有RNA的损失。根据这一特点，可应用试剂甲基绿对DNA染色的特异性和派诺宁对RNA的亲和性，使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着染，如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色者为凋亡细胞，呈阴性染色者为坏死细胞。 二、细胞凋亡的检测方法 甲基绿-派诺宁染色：光学显微镜下凋亡细胞和坏死细胞均表现为细胞固缩：其中凋亡细胞细胞核呈绿色或绿蓝色着染，胞质呈红紫色着染，坏死细胞只有固缩细胞，核绿色着染，而细胞质无染色。 （2）荧光显微镜检测—溴化丙锭（PI）染色： 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。 （3）透射电子显微镜：已经用于凋亡细胞的检测。镜下可见凋亡细胞体积变小、细胞质浓缩、细胞核变小、染色质浓缩并凝结成块，出现染色质沿核膜内侧排列的核边集现象。晚期的凋亡细胞，清晰可见细胞核裂解产生的凋亡小体。 2、生化检测法 （1）凝胶电泳法： （2）原位末端标记法 （3）二苯胺分光光度法 二、细胞凋亡的检测方法 （1）凝胶电泳法 原理：凋亡细胞的突出特征是由于内源性核酸内切酶的激活而导致细胞核DNA的断裂。典型的细胞凋亡，在核内形成大量200bp大小及其倍体的核苷酸片段，而非典型的凋亡细胞，由于核内的DNA降解不完全，仅形成300~50kb的DNA大片。利用这一特性，可通过DNA凝胶电泳来判定凋亡的发生和发展情况。 方法：提取总DNA DNA凝胶电泳 观察DNA ladder现象 凝胶电泳特点(1) 本方法不能检测单个细胞水平的凋亡。(2) 不能提供细胞发生凋亡所处的组织位置和细胞分化状态。 （2）原位末端标记法（TUNEL） 原理：利用标记的dUTP，在TdT作用下结合DNA断片的3’末端羟基，显示断链DNA，提示凋亡 方法：制备组织切片 标记物结合 标记物显色 镜检 TUNEL染色：细胞核固缩有的呈碎片状，不规则，大小不一致，呈棕黄色颗粒者为阳性细胞。 即凋亡的细胞 （3）二苯胺分光光度法 原理：细胞凋亡可产生低分子量DNA，通过超速离心可与细胞核的高分子量DNA分离，分别测定两种DNA，即可得出凋亡百分率。 方法：裂解细胞 13000g超速离心 分别提取DNA 使DNA显色，测定 凋亡百分率 = 上清液OD值 上清液OD值+沉淀OD值 3、流式细胞仪法 原理：PI标记凋亡细胞，通过FACS可显示凋亡细胞的特征性亚二倍体峰。并可经计算分析得出凋亡百分率。 方法：制备细胞悬液 PI染色 FACS检测 二、细胞凋亡的检测方法 本章小结 1、免疫细胞的类型与分离技术 2、细胞的冻存与复苏 3、免疫细胞膜分子的检测原理与方法 4、免疫细胞功能测定的原理与方法 * * * * * * * * * * * * * * * * EA-花环：B淋巴细胞表面有Fc受体，能与免疫球蛋白的Fc段结合，因此用抗体致敏的红细胞与B淋巴细胞混合，可见B淋巴细胞周围粘附有红细胞 EAC-花环：B淋巴细胞表面有补体受体，在抗体致敏的红细胞中加入补体，可形成红细胞-抗体-补体复合物，再与B淋巴细胞混合，则可形成EAC玫瑰花环。 第三节 免疫细胞功能测定 一、转化、增殖试验 二、细胞毒试验 三、抗体形成试验 四、细胞吞噬与杀伤试验 1、淋巴细胞转化试验：刺激物分为非特异性（如植物血凝素、刀豆素A等）