RNA提取其他常见问题分析解答-聚合美.PDFVIP

北京聚合美生物科技有限公司Mei5 Biotechnology, Co., Ltd RNA 提取其他常见问题分析解答 Q-1：一个典型的哺乳动物细胞包含多少的 RNA？ A-1： RNA 含量的多少在很大程度上取决于细胞类型的以及发展阶段，一般情况下，一个典型的哺乳动物细胞会含有 10-30pg 的总 RNA，RNA 的绝大部分是 tRNA 和 rRNA，mRNA 大约占据细胞总 RNA 的 1-5%，当然更精确的数量依赖于细 胞的类型和物理阶段。一个单的哺乳动物细胞中大约有 360,000 个 mRNA 会存在，构成了大约 12000 个不同的转录产 物，这些转录产物的大小大约在 2kb 左右。 Q-2：怎么样对用聚合美试剂盒提取出来的 RNA 进行定量？ A-2： 采用聚合美试剂盒提取的 RNA 浓度可以采用分光光度计检测 A260 的吸收峰来进行计算，吸收峰的读数应该大于0.15 才具有意义，1 unit 的 A260 的吸收峰相当于 40ug 的 RNA/ml，（A260=1=40ug/ml）,这种相关性在水中的测量是有效 的，从而可以采用风光光度计的方法来进行定量。 举例如下： RNA 样品体积=100ul 稀释=10ul 的 RNA+490ul 的稀释水（1/50 的稀释度） 测量在 1ml 量杯中的稀释样本的吸收峰：A260=0.27 原始 RNA 样品的浓度=40*A260*稀释度=40*0.27*50 RNA 浓度为：540ug/ml 总产量=浓度*样品的体积=540ug/ml*0.1ml RNA 产量：54ug。 Q-3：在 RNA 的制备物中，如果 A260/230 的比率比较低对下游实验的应用有什么影响？ A-3： 下游应用的效率很大程度上依赖于使用的 RNA 样本的纯度，比较纯的 RNA 的 A260/230 的值应该在 2 左右，稍微高一 些也是可以的，但是，没有公认的这个比值的下限是多少，以下的物质会增加 A230 的值，包含：盐离子，碳水化合 物，多肽以及酚（或者一般的芳香化合物），一般情况下，RNA 样品中，230nm 的吸收峰的增加是由于异硫氰酸胍的 污染引起的，这种异硫氰酸胍在大部分的 RNA 提取过程中的裂解和提取的试剂中都会被使用到。同时，实验发现 RNA 样品中异硫氰酸胍的浓度少于 100mM 的时候，不会影响下游实验的应用。 北京市昌平区回龙观龙域北街10 号院1 号楼四层422-1 室（创集合大楼） 热线电话： （86 ）010 北京聚合美生物科技有限公司Mei5 Biotechnology, Co., Ltd Q-4：怎么判断提取的 RNA 的纯度？ A-4： 用试剂盒提取出来的 RNA 的纯度可以用 260/280 的比值来对纯度来进行评估，这个比值可以用来判断是否在紫外吸 收下是否有蛋白污染等。 需要注意的是：A260/280 的比值会受 pH 值的影响，因为水不是缓冲液，所以pH 值 260/280 的比率的改变会非常大， 对一个纯度的精确确定来说，我们推荐测量 260/280 的值在 10mM 的 tris-cl,ph7.5 的情况下进行，确保用同样的溶 液测量分光光度值，纯的 RNA 的 260/280 的值在 1.9-2.1，但是，经常对于一些风光光度计来说，在 10mM tris，ph7.5 的情况下，对于一些比值到达 2.3 时也是正常的。 Q-5：对于一些小量的 RNA 和 DNA 的定量，可以替代 A260 测量的方法是什么？ A-5： 少量的 DNA 或者 RNA 可能很难用风光光度计来进行定量，荧光测量或者是定量 RT-PCR 和荧光定量 PCR 对于少量的 DNA 或者 RNA 的定量会更灵敏和更精确一些。 荧光测量可以采用核酸结合染料，例如 RiboGreen® RNA 定量试剂作为 RNA 定量，以及 PicoGreen® DNA 定量试剂作 为 DNA 定量（分子探针，等等） Q-6：怎么样判断用提取出来的 RNA 的完整性？ A-6： RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度 1.2%；0.5×TBE 电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。由于 细胞中 70%-80%的 RNA 为 rRNA，电泳后 UV 下应能看到非常明显的 rRNA 条带。动物 rRNA 大小