慢病毒载体包装构建过程..pdfVIP

慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染 色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效 地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞 等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转 染的细胞， 如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载 体，能大大提高目的基因或目的shRNA 的转导效率，且目的基因或目的 shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实 现目的基因或目的shRNA 的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒 载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是 慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病 毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗 粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表 达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括： 慢病毒包装质粒和可产生病毒 颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包 装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有 辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同 时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到 细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感 染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而 高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。 包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用 序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常 被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表 达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与 载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收 获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗 粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺 式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入 的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的 同源性，如将包装成分上5ʹLT R换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、 3ʹLT R换成SV40 polyA等。 一、 实验流程 （1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD 酶，3K 内突变率为0%)从模板中 （CDNA质粒或者文库）调取目的基因 CDS 区 （coding sequence ）连入T载体。将CDS 区从T载体上切下，装入慢 病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进 行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养 基，培养24和48h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上 清液通过超离心浓缩病毒。 二、实验材料 2.1慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pLVX-IRES- ZsGreen1/pLVX-shRNA2 。其中质粒上的ZsGreen1表达框能表达绿色荧光 蛋白 （GFP）。 载体信息 1) 慢病毒克隆载体图谱如下： 2 ） 包装质粒信息如下： PMD2G载体图谱和序列信息 PSPAX2载体图谱和序列信息： 细胞株 293T ，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长 培养基为DMEM(含10% FBS) 。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 菌株大肠杆菌菌株DH5α 。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、流程图