微生物基因号工程第六-.pptVIP

第六章 外源基因的表达 6.1 基因表达的机制 6.1.1 外源基因的起始转录 6.1.2 mRNA的延伸与稳定性 6.1.3 外源基因mRNA的有效翻译 6.1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性 6.1.5 目的基因沉默 6.1.1 外源基因的起始转录 选择可调控启动子和相关调控序列 原核生物：诱导型启动子和组成型启动子 诱导型启动子：lac、trp、 PR、PL、tac 组成型启动子：T7 真核生物：启动子和增强子 6.1.2 mRNA的延伸与稳定性 外源基因起始转录后，保持mRNA的的有效延伸、 终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。 在构建表达载体时，尽量避免衰减子序列、加入抗终止序列，转录终止序列、poly(A)掺入位点（真核生物）。 选择RNase缺失受体菌（原核生物）。 6.1.3 外源基因mRNA的有效翻译 在原核细胞中影响翻译的起始因素有：起始密码子、核糖体结合位点（SD序列）、起始密码与SD序列之间的距离和碱基组成、mRNA的二级结构、mRNA上游的5′非翻译序列和蛋白质编码区的5′端序列等。 外源基因mRNA有效翻译须考虑的基本原则 原核生物 真核生物 6.1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性 外源基因表达产物能否在宿主细胞中稳定积累而不被内源蛋白水解酶水解是基因有效表达的一个重要因素。 避免外源基因表达蛋白降解的措施： (1) 构建融合蛋白表达系统 (2) 构建分泌蛋白表达系统 (3) 构建包涵体表达系统 (4) 选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统 6.1.5 目的基因沉默 目的基因沉默(gene silencing)： 某种原因导致外源基因不能正常表达 主要表现在转基因动物和植物中 位置效应的基因沉默 转录水平的基因沉默 转录后水平的基因沉默 6.2 基因表达的调控元件 6.2.1 启动子 6.2.2 增强子 6.2.3 终止子 6.2.4 衰减子、绝缘子和反义子 6.2.1 启动子 启动子 定义、特征 （1）序列特异性 （2）方向性 （3）位置特性 （4）种属特异性 原核生物启动子 真核生物启动子 6.2.2 增强子 增强子(enhancer)：能增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列，由多个元件组成，每个元件可以与一种或多种转录调控因子结合。 增强子的特性： (1) 双向性 (2) 重复序列 (3) 增强子行使功能与所处位置无关 (4) 特异性 (5) 增强子与同源或异源基因相连时均有调控功能 6.2.3 终止子 终止子(terminator) 本征终止子 不需要其他蛋白辅助因子便可在特殊的结构区内实现终止作用。 依赖型终止子 需要其他蛋白辅助因子才可在特殊的结构区内实现终止作用。 6.3 影响外源基因表达的因素 6.3.1 外源基因的表达效率 6.3.2 表达质粒的拷贝数和稳定性 6.3.3 表达产物的稳定性 6.3.4 工程菌的培养条件 6.3.5 细胞的代谢负荷 6.3.1 外源基因的表达效率 启动子的强弱 核糖体结合位点的有效性 SD 序列和起始密码子AUG 的间距 密码子组成 6.3.2 表达质粒的拷贝数和稳定性 6.3.3 表达产物的稳定性 组建融合基因，产生融合蛋白 产生可分泌的蛋白 外源蛋白可以在宿主细胞中以包涵体形式表达 选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞 采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性 6.3.4 工程菌的培养条件 优化发酵过程 工艺因素 如选择合适的发酵系统或生物反应器 生物学因素 首先是与细菌生长密切相关的条件或因素，如发酵系统中的溶氧、pH 值、温度和培养基的成分等 对外源基因表达条件的优化是提高外源基因表达产物的总量。 外源基因表达产物的总量取决于外源基因表达水平和菌体浓度 6.3.5 细胞的代谢负荷 外源基因在细菌中高效表达，必然影响宿主的生长和代谢，而细胞代谢的损伤，又必然影响外源基因的表达。合理地调节好宿主细胞的代谢负荷与外源基因高效表达的关系，是提高外源基因表达水平不可缺少的一个环节 6.4 外源蛋白的融合表达及分泌表达 6.4.1 基因融合表达外源蛋白的原因 6.4.2 基因融合的策略 6.4.3 外源基因在大肠杆菌中的分泌表达 6.4.1 基因融合表达外源蛋白的原因 外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解