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CRISPR-Cas9大全：基因敲除、点突变、基因插入 2015-10-15 CRISPR-Cas系统简介 CRISPR-Cas系统的应用技术 CRISPR-Cas系统的应用前景 1. CRISPR-Cas系统简介 1.1 CRISPR-Cas系统的研究历史 1987 年，日本课题组在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002 年，正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列 2005 年发现CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测细菌可能通过CRISPR 系统可能以类似于真核生物的RNAi 方式抵抗外源遗传物质的入侵。 2007 年，Barrangou 等首次发现细菌可能利用CRSPR 系统抵抗噬菌体入侵；2008 年，Marraffini 等发现细菌CRISPR 系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了CRISPR 系统的功能 2013 年初，MIT 的研究组首次利用CRISPR/Cas9 系统对人293T 细胞EMX1 和PVALB 基因以及小鼠Nero2A 细胞Th 基因实现了定点突变。同年Mali 利用CRISPR/ Cas9 在人293T 细胞和K652 细胞基因的靶位点形成双链或单链的切口，从而激活细胞的DNA 修复机制高效介导外源基因定点插入。 1.2CRISPR-Cas系统的结构 CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列R( repeat) 与长度相似的间区序列S( spacers) 间隔排列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列CRISPR 相关蛋白基因cas。 Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。 1.3 CRISPR-CAS 系统的作用机理 CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 首先识别入侵的核酸和扫描外源 DNA 潜在的 PAM（NGG序列），将临近 PAM 的序列作为候选protospacer；然后在 CRISPR 基因座的5端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间 1.3 CRISPR-CAS 系统的作用机理 CRIPSR 基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工) 当该噬菌体再次入侵细菌时，CRISPR 簇首先转录为长的crRNA前体，然后逐步被加工成小的成熟的crRNA。 CRISPR/Cas 系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰 crRNA 结合相关的Cas 蛋白后，形成crRNA-Cas 蛋白复合体，通过碱基互补配对精确地与目标DNA相结合，随后Cas 蛋白对目标DNA 进行断裂和降解。 1.3 CRISPR-CAS 系统的作用机理 2、CRISPR-Cas系统的应用 2.1 CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑技术 基因组编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。 这种技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。 通过修复途径，基因组编辑技术可以实现三种基因组改造，即基因敲除，特异突变的引入和定点转基因 基因组编辑是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人类遗传性疾病的治疗，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点 2.1 CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑技术 CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。 Mali 等人 利用来自酿脓链球菌和嗜热链球菌中的CRISPR 相关蛋白Cas9，在一段人为重组的sgRNA( small-guide RNA) 的引导下，针对小鼠和人类基因组的特定基因片段实现了精确的剪切。这种通过可编程RNA 进行DNA 改造的技术为基因组编辑开创了一条新的途径。 例子：基因敲除的实验过程 1、在把基因序列中寻找NGG序列获得其附近20多个碱基的序列，与tracrRNA序列融合，设计出sgRNA并合成该序列。 2、将该序列以及cas9基因连入如图所示载体。 3、转化感受态，质粒小提，测序验证。 4、细胞培养与细胞转染 5、敲除效果检测。 6、建立稳定敲除的细胞株 2.2CRISPR/Cas9介导的转录抑制与转录激活 在CRISPR/Cas9的Ⅱ型系统中将Cas9中的切割域突变，会使Cas9蛋白失去对ＤＮＡ的切割活性，但不影响其与ＤＮＡ 结合的能力。这种失去ＤＮＡ切割活性的Cas9蛋白被命名为Dead Ｃas9。将