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第十二章
印迹杂交技术
Molecular hybridization
印迹技术(blot)
——指将电泳分离的样品(核酸或蛋
白质)从凝胶转移到印迹膜上,然后
与标记探针进行杂交来检测样品的方
法。
• 印迹法分类:
Southern Blot DNA印迹
Northern Blot RNA印迹
Western Blot 蛋白质印迹(免疫印迹)
Eastern Blot Western Blot的一种变形
第一节 核酸杂交的
基本概念
温度、酸碱、有
机溶剂、尿素等
核酸变性:在某些理化因素作用下,核
酸分子互补双链之间氢键断裂,使双螺
旋结构松散变成单链的过程。
DNA变性:在变性因素作用下,DNA分
子互补双链之间氢键断裂,使双螺旋结
构解开成两条单链的过程。
DNA复性(renaturation):在适当条
件下,变性DNA的两条互补链可恢复天
然的双螺旋构象。
退火(annealing):热变性的DNA经缓
慢冷却后即可复性。
DNA 变性的本质是双链间氢键的断裂
变性引起紫外吸收值的改变
DNA 的紫外吸收光谱
• 增色效应:核酸在变性过程中260nm
波长吸收值(A260 )增加
• 减色效应:核酸在复性过程中260nm
波长吸收值(A260 )减小
DNA加热
50%DNA
发生变性
此时的温度——解链温度
(melting temperature, Tm)
G—C百分含量与Tm的关系
核酸分子杂交
单链的核酸分子在合适条件下,与具有碱
基互补序列的异源核酸形成杂化双链的过
程。
• 核酸分子杂交可在DNA与DNA、DNA与RNA、RNA
与RNA的两条单链间进行。
核酸分子杂交的体系
液相杂交:待测核酸和探针均游离于溶液。
固相杂交(常用):将待测核酸(或探针)固
定于固相支持物,然后与溶液中的游离探针(或
待测核酸)进行杂交,形成的杂交体结合于固相
支持物上。
第二节 核酸探针与
标记
探针(probe)
——能与待测的分子发生特异性相互作用,
并可被特殊的方法探知的分子(带有标记
物)。
• 探针的检测对象:核酸、蛋白质、细胞结构等。
• 除核酸探针外,探针利用抗体-抗原、配体-受
体等相互作用的原理与靶分子结合。
一、核酸探针
——带有标记物且序列已知的核酸片段,
能与待测核酸中的特定序列特异杂交。
• 核酸探针是否合适是决定核酸杂交分析
能否成功的关键。
核酸杂交与分子探针
核酸探针应具有的条件
① 特异性高:只与待测核酸样品中的
互补序列杂交。
② 带有标记物:标记物灵敏度高而稳
定,检测方便。
核酸探针的种类
基因组DNA探针
cDNA探针
RNA探针
寡核苷酸探针
基因组DNA探针
• 直接从基因组文库中筛选后、酶切制备;
或用PCR扩增基因组中的目的基因制备。
• 包含目的基因的全部序列或部分序列,
是最常用的DNA探针。
• 优点:制备简便;不易降解;标记方法
成熟。
• 注意:尽可能用基因的编码顺序(外
显子)作为探针。
cDNA探针
优点:mRNA逆转录而来,不含内含子等
非编码区,特异性高;适用于研究基因表达。
缺点:获取过程复杂,不易制备
RNA探针
① 是单链探针,所以
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