350AG多态位点荧光素酶表达载体的构建与鉴定及活性检测.PDFVIP

窑论 著 窑 中国医药导报 2015年9月第12卷第27期 人多巴胺D2基因启动子区-350A/G多态位点 荧光素酶表达载体的构建与鉴定及活性检测 段朝霞 张洁元 陈魁君 李晓霞 许 川 王建民 李兵仓 第三军医大学大坪医院野战外科研究所 创伤尧烧伤尧复合伤国家重点实验室袁重庆 400042 [摘要] 目的探讨人多巴胺D2渊DRD2冤基因启动子区-350bp位点单核苷酸多态性渊rs1799978冤对DRD2基因转录 活性的影响袁为进一步揭示DRD2基因启动子区单核苷酸多态性的功能及其对创伤应激障碍综合征易患性的分 子机制奠定基础遥 方法 以人全血基因组DNA为模板袁 分别扩增DRD2基因启动子区-350bp处分别为A或G 的目的片段渊-1000bp耀+168bp冤袁与经过改建的报告基因空载体pmirGlo-promoter相连接袁构建启动子区-350bp 处分别为A和G的重组荧光素酶报告基因表达载体袁并通过限制性内切酶双酶切及测序进行鉴定袁然后将构建 好并经过鉴定的表达载体pmirGlo-promoter-A和pmirGlo-promoter-G分别与pRL-CMV瞬时共转染人胚肾癌细 胞株HEK293袁48 h后检测细胞中荧光素酶的相对表达量遥 结果 双酶切及测序结果证实袁成功构建了重组荧光 素酶表达载体pmirGlo-promoter-A和pmirGlo-promoter-G曰 荧光素酶活性检测结果显示袁pmirGlo-promoter-G 的 荧光素酶基因表达量显著高于pmirGlo-promoter-A袁差异有高度统计学意义渊P0.01冤遥 结论成功构建了pmir鄄 Glo-promoter-A/pmirGlo-promoter-G荧光素酶报告基因重组质粒袁DRD2基因启动子区-350bp为G时袁 基因转 录活性较高袁为A时袁基因转录活性较低袁说明rs1799978多态位点由A突变为G后袁可能增强基因转录活性袁该 结果为进一步深入研究DRD2基因启动子区-350bp单核苷酸多态性的生物学功能奠定了实验基础遥 [关键词] 多巴胺受体D2曰启动子区曰单核苷酸多态性曰荧光素酶活性 [中图分类号] R78 [文献标识码]A [文章编号] 1673-7210渊2015冤09渊c冤-0004-05 Construction and identification of fluorescent reporter plasmid for -350 A/G polymorphism in human Dopamine receptorD2 promoter regionand itsactivity detection DUAN Zhaoxia ZHANG Jieyuan CHENKuijun LIXiaoxia XU Chuan WANGJianmin LIBingcang Research Institute of Field Surgery, Daping Hospital,Third Military Medical University State Key Laboratory of Trau鄄 ma, Burnsand CombinedInjury, Chongqing 400042, China [Abstract] Objective To investigate the effects of single nucleotide polymorphism (SNP) in -350 bp (rs1799978) of DopaminereceptorD2(DRD2)geneontranscriptionactivityandanalyzethemechanismofgeneregulation.MethodsThe promoter region sequences of DRD2 gene A or G at site -350 bp (-1000 bp to +168 bp) were amplified using whole blood genomi