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皮质发育不良大鼠差异蛋白筛选和其致痫作用探析 【摘要】目的寻找皮质发育不良大鼠脑组织（皮 质和海马）与正常对照组织在不同发育阶段的差异表达蛋白 质，探讨这些蛋白质在皮质发育不良所致癫痫发生机制中的 作用。方法妊娠晚期（孕17 d） Sprague-Dawley大鼠腹腔 注射卡莫司汀（15 mg/kg）诱导仔鼠皮质发育不良。提取新 生期（出生后7 d,记作P7）及成年仔鼠（P60）新皮质及 海马组织蛋白，运用双向凝胶电泳技术构建卡莫司汀诱导皮 质发育不良鼠和正常鼠皮质及海马组织在新生期及成年期 的蛋白质表达谱，通过比对分析筛选出差异表达的蛋白质斑 点。应用MALDI-TOF-MS技术平台对差异最为显著的部分蛋 白进行鉴定。结果在模型组和对照组之间共筛选出57个差 异表达蛋白质斑点（P 皮质发育不良（Cortical dysplasia, CD）是难治性癫痫的重要病因之一，但CD的致 痫机制仍有待进一步阐释。比较蛋白质组学技术是一种新型 的髙通量差异蛋白筛查技术，正在逐步运用到神经病学研究 的各个领域。我们采用卡莫司汀诱导的CD大鼠模型，运用 双向电泳技术对比分析CD大鼠和正常大鼠皮质及海马组织 在不同发育时期（新生期和成年期）的蛋白质表达谱，筛选 出差异表达的蛋白质斑点并应用MALDI-TOF-MS技术平台进 行鉴定，以期进一步探讨皮质发育不良癫痫易感性的发生机 制并发现新的治疗靶点。 1材料与方法 1.1动物模型的建立与实验分组 健康怀孕Sprague-Dawley大鼠5只由浙江中医药大学 实验动物中心提供，孕］7 d （Embryonic day 17, E17）, 体质量270?320 go于E17随机选取3只孕鼠腹腔内注射卡 莫司汀（天津金耀制药厂），给药剂量为15 mg/kg, E22仔 鼠出生，所产雄性仔鼠存活11只归入模型组；余下2只孕 鼠在同一天腹腔内注射同等剂量生理盐水，所产雄性仔鼠存 活16只入对照组。仔鼠出生当天记作P0,到P21与母鼠分 开饲养。P7随机（随机数字法）选取模型组和对照组仔鼠各 3只，行病理切片对照检查验证制模成功。 1.2蛋白质样品的制备与双向凝胶电泳 在P7和P60分别随机（随机数字法）选取模型鼠和对 照鼠各3只，留取前额部分新皮质并分离海马组织［1］,所 得标本液氮中速冻后-80工保存。 取大约300 mg样本，PBS清洗后切碎成1 mm3见方的小 块，转移至匀浆器中，加入2D裂解液（9.5 mol/L尿素， 65 mmol/L DTT, 4% CHAPS, 0. 2% IPG 缓冲液，按 1 ： 50 加入蛋白酶抑制剂约1 mL,均来自美国sigma公司），匀浆 20次，全过程在冰上完成。将匀浆液转入离心管中，超声破 碎细胞（80 W, 5次，每次10s,间隔15 s,冰上完成）。12 000 g离心45 min,取上清液蛋白定量后-80 ￡低温保存。 双向电泳：上样100 ug, IEF为pH 3?10非线性胶条 （瑞典 Amersham 公司），电泳在 Ettan IPGphor Isoelec trie Focusing System 和 Hofer SE 600 （美国 GE Amersham 公司） 中进行（电泳条件：30 V 12 h, 500 V 1 h, 1 000 V 1 h, 8 000 V 8 h, 500 V 4 h）, SDS为 12. 5%的胶，先 15 mA/ 胶30 m,然后换30 mA/胶至澳酚蓝离胶下沿0.5 cm）。每 个样品常规进行3次双向电泳，银染后经UMax Powerlook 2110 XL （美国GE Amersham公司）扫描，获得图谱。采用 ImageMaster 2D软件对图像进行背景消减、蛋白质点检测和 校正，获取蛋白质点的位置坐标和表达量等分析。 1.3质谱扫描与数据库搜索 选取并切下差异点（表达量比＞1.8）,做胶内酶解，每 个胶粒切碎后放入离心管中，每管加入30?50 UL30 mmol/L K3Fe （CN） 6 : 100 mmol/L Na2S203=l : 1 （体积比）脱色， 冻干后，加入5 P L 2?5?10.0 ng/ P L测序级Trypsin （Promega）溶液，37 ￡反应过夜，20 h左右；吸出酶解液, 转移至新管中，原管加入100 1L 60% ACN /0. 1% TFA,超 声15 min,合并前次溶液，冻干；若有盐，则用Ziptip （美 国Millipore公司）进行脱盐。 样品与5 mg/mL HCCA基质1： 1混合后，用4800串联 飞行时间质谱仪（美国Applied Biosystems公司）进行质 谱分析，激光源为355 nm波长的Nd： YAG激光器，加速电 压为2kV