奶粉中病源微生物的分子生物学检测.PDF

奶粉中病源微生物的分子生物学检测 前 言 随着经济的发展以及人们对先进技术掌握的逐步完善，奶粉 多份研究报告表明婴儿配方奶粉是当前发现致婴儿、早产儿 中病源微生物导致的安全和健康问题，引起了人们对病源微 脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎的主要感染渠道，故配方奶 生物检测的重视。本文以目前奶粉中最新关注的病源微生物 粉中阪崎肠杆菌污染问题成为世界瞩目的焦点。 阪崎肠杆菌的生物学检测为例，借助 Eppendorf 高品质的 实验室仪器家族，帮您构建奶粉中病源微生物检测的分子生 2005 年 5 月 20 日，由中国检验检疫科学研究院和天津检 物学平台。 验检疫局牵头完成的《奶粉中阪崎肠杆菌检测方法》行业标 准在京通过审定。该标准的建立为管理部门提供了更有效的 阪崎肠杆菌 （Enterobacter sakazakii ）是人和动物肠道 执法依据，为企业质量控制提供了有力的技术手段，对降低 内寄生的一种革兰氏阴性无芽孢杆菌，属肠杆菌科的一种。 婴幼儿配方奶粉的风险，保证代乳品的安全性具有十分重要 该菌在一定条件下可引起人和动物致病，因此被称为条件致 的意义。 病菌。 奶粉中阪崎肠杆菌检测方法及其比较 目前，阪崎肠杆菌的实验室检测方法包括：改进的传统检测方法（经典方法）、普通PCR 方法与荧光PCR 方法 （快速筛选方法）。 FAO/WHO （联合国粮农组织/ 世界卫生组织）在 2004 年召开了 2 次国际相关会议，与会专家倡导采用国际通用的分子生物 学方法，以弥补传统方法的局限性。 项目 经典方法 分子生物学方法（快速筛选方法） BAM PCR PCR 结晶紫中性红胆盐琼 细菌 16S-23S rDNA 间区序列 （ITS ）的 在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信 脂平板培养符合革兰 可变区存在着种属间的差异性，利用阪崎 号累积，实时检测整个 PCR 过程，最后通过标 阴性无芽孢肠杆菌生 肠杆菌 ITS 特有的序列设计引物，扩增出 准曲线对模板进行定量分析 化特征 特异性基因片段 培养基准备，平板培 （1）普通PCR： （1）荧光定量PCR： 养，菌落记数，生化 一次性加好各种反应物后，在 PCR 扩增 一次性加好各种反应物后，在荧光定量 PCR 扩 鉴定 仪中进行 增仪中进行 （2 ）普通PCR 的后处理： （2 ）扩增完成进行中或完成后进行数据分析 PCR 扩增结束后，可以采用多种方法对 扩增产物进行分析 最常用的包括：凝胶电泳分析、分子杂交、 限制性内切酶分析、核酸序列分析 4-6 天 3-5 小时 2 小时内 （1）无特殊设备要求 普通与荧光定量PCR 共同优点： （2 ）方法经典可靠 （1）利用阪崎肠杆菌ITS 特有的序列，特异性强 （3 ）可直观判断细菌 （2 ）灵敏度高，对于细菌学最小检出可达到3-10 个细菌 活与死 （3 ）操作简便快速 荧光定量PCR 独有特点