血涂片制备与染色及质量控制.doc

PAGE PAGE 1 血涂片制备与染色及质量控制 血涂片是通过特定的方法将血液按一定方向均匀涂开的过程，微观上使细胞是由球形变为平面形或近平面形平铺在载玻片上。血涂片的显微镜检查是血液细胞形态学检查的基本步骤，特别是对于各种血液病的诊断和鉴别诊断，具有重要价值。血涂片制备是否合格、染色的好坏直接关系到检验结果的质量。 （一）血涂片制备 1.载玻片的准备 新载玻片常带有游离碱质，须用浓度为lmol/L的HCl浸泡24h，再用清水彻底冲洗，干燥后备用。旧载玻片要用含洗涤剂的清水中煮沸20min，洗掉血膜，再用清水反复冲洗，最后用0.95L/L乙醇浸泡1h，干燥备用。 使用载玻片时，不要用手触及玻片表面，保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。 2.血涂片制作方法 取血液标本一滴置载玻片的一端，以边缘平滑的推片一端，从血滴前沿方向接触血液，使血液沿推片散开，推片与载玻片保持30～45○夹角，平稳地向前推动，血液即在载玻片上形成薄层血膜。 涂片的厚薄与血滴大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及血细胞比容有关。血滴大、角度大、速度快则血膜越厚；反之则血膜越薄。 一张良好的血涂片，要求厚薄适宜，头体尾明显，细胞分布均匀，血膜边缘整齐并留有的空隙。 （二）血涂片染色 染色的目的是使细胞的主要结构，如细胞膜、细胞质、细胞核等染上不同的颜色，以便于镜下观察识别。 血涂片染色包括两个过程：固定和染色。固定是将细胞蛋白质和多糖等成分迅速交联凝固，以保持细胞原有形态结构不发生变化。常用的染色方法有瑞特染色法(Wright)、姬姆萨染色法(Giemsa)等。 1.瑞特（Wright）染色法 本法的特点是将固定和染色合并在一起进行，手续简便，染色时间短，对白细胞特异性颗粒着色较好，但对核的着色略差。 （1）瑞特染料 由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料。伊红为钠盐，有色部分为阴离子。美蓝为氯盐，有色部分为阳离子。美蓝和伊红的水溶液混合后，产生一种不溶于水的伊红化美蓝(ME)中性沉淀，即瑞特染料，溶解于甲醇中，即成为瑞氏染液。甲醇的作用一方面使ME溶解，并解离为M＋和E－，两种有色离子可以选择性地与细胞内不同成分结合。另一方面因其具有强大的脱水作用，可将细胞瞬间固定，蛋白质被沉淀为颗粒状或者网状结构，表面积增加，提高对染料的吸附作用，增强染色效果。 （2）缓冲液 pH6.4～6.8的磷酸盐缓冲液，其作用是使染色环境维持在弱酸性，达到最佳的染色效果。 （3）细胞的着色原理 细胞的着色既有化学的亲合作用，又有物理的吸附作用。不同的细胞由于其所含化学成分不一样，化学性质各不相同，所以对染料的亲合力也不一样。 ①细胞中的碱性物质与酸性染料伊红结合染成红色，因此，该物质又称为嗜酸性物质。如红细胞中的血红蛋白及嗜酸粒细胞中的嗜酸性颗粒等与伊红结合。 ②细胞中的酸性物质可与碱性染料美蓝结合而染成蓝紫色，该物质又称嗜碱性物质。如淋巴细胞胞质及嗜碱粒细胞的颗粒为酸性物质，与碱性染料美蓝结合。 ③中性颗粒呈等电状态与伊红美蓝均可结合，染淡紫红色为中性物质。另外细胞核蛋白主要由脱氧核糖核酸和强碱性的组蛋白等组成，与酸性伊红结合染成红色，但因核蛋白中还含有少量的弱酸性物质，与碱性美蓝作用染成蓝色，因含量太少，蓝色反应极弱，故也被染成紫红色。 ④原始红细胞和早幼红细胞的胞质含有较多的酸性物质，与美蓝亲合力强，故染成较浓厚的蓝色；随着细胞的发育，晚幼红细胞阶段既含有酸性物质，又含有碱性物质（Hb），既能与碱性染料美蓝结合，又能与酸性染料伊红结合，故染成红蓝色或灰红色；当红细胞完全成熟，酸性物质彻底消失后，只与伊红结合，则染成粉红色。 （4）pH对细胞染色的影响 细胞着色对氢离子浓度十分敏感。细胞各种成分均由蛋白质构成，由于蛋白质是两性电解质，所带电荷的正负数量随溶液pH值而定。对某一蛋白质而言，如果环境的pH小于其等电点（PI），则该蛋白质带正电荷即在酸性环境中正电荷增多，易与酸性伊红结合，染色偏红；相反，当环境的pH大于PI即在碱性环境中负电荷增多，则易与美蓝结合染色偏蓝。因此，要使用清洁中性的载玻片、优质的甲醇做溶剂和用缓冲液(pH6．4～6．8)来调节染色时的pH值，达到满意的染色效果。 （5）染色效果分析 正常情况：血膜外观呈淡粉红色或琥珀色。显微镜下，成熟红细胞呈粉红色。白细胞胞质中颗粒清楚，并显示出各种细胞特有的色彩，细胞核染紫红色，核染色质结构清楚。 染色偏酸：红细胞和嗜酸粒细胞颗粒偏红，白细胞核呈淡蓝色或不着色。 染色偏碱：所有细胞呈灰蓝色，颗粒深暗；嗜酸粒细胞可染成暗褐色，甚至紫黑色或蓝色；中性颗粒偏粗，染成紫黑色。 2.姬姆萨(Giemsa)染色法 姬姆萨染料由天青和酸性染料伊红组成的复合染料。染色原理、缓冲液与瑞特染色法大致相同。本法对细胞