课件：实验五过氧化物同工酶PAGE分析.ppt

实 验 五 过氧化物同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析 （P98） 一、目的 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术的原理和操作方法 掌握PAGE法分离过氧化物同工酶的原理和方法 二、原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 过氧化物同工酶及活性染色 （一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）P20 1.电泳概念 电泳：带电粒子在电场中向与其电性相反的电极移动的现象。 ○ ○ ○ ○ — + + - + - （一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 2.电泳分类 显微电泳 自由界面电泳 区带电泳 纸电泳 醋酸薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） （一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 3.电泳法原理 在一定条件下，任何带点颗粒都有自己特定的电泳迁移率。影响电泳迁移率的因素： 颗粒性质： 净电荷数目 颗粒大小 颗粒形状 电场强度：V/cm 溶液性质： 缓冲液的pH 离子强度 溶液黏度 电渗：液体对固体支持物的相对移动 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）和催化剂过硫酸铵（AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE) （一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 4.聚丙烯酰胺凝胶电泳 反应过程 TEMED催化AP生成硫酸自由基 S2O82－ 2SO4·ˉ 硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链： Bis将单体长链间连成网状结构： PAGE法分离蛋白质的三种效应 电荷效应：各种蛋白质分子所带电荷不同，在同一电场中泳动率不同； 分子筛效应；蛋白质分子大小和形状各不相同，在通过一定浓度（一定孔径）凝胶时受阻力各不相同，泳动率也不相同； 浓缩效应：凝胶为不连续系统（凝胶层、pH、电位梯度均不连续），从而使样品浓缩在一个极窄的起始区带，即所谓浓缩效应，提高了条带分辩率。（只有不连续凝胶具有此效应） （二）过氧化物同工酶及其活性染色（P98） 同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构及其理化性质不同的一组酶。 同功酶是机体调节酶活性的一种方式，在各种生物体中广泛存在。 过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 本实验采用PAGE技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。 过氧化物+过氧化物酶 → 复合物 复合物+DH2 → 过氧化物酶+H2O+D H2O2 联苯胺 棕色物质 （二）过氧化物同工酶及其活性染色（P98） 三、材料、仪器和试剂 材料：小麦幼苗 仪器：电泳仪、电泳槽、高速离心机、量筒、烧杯、微量注射器、研钵、染色盒 三、材料、仪器和试剂 试剂： A液：30%Acr-0.8%Bis B液：Tris+EDTA C液：TEMED D液：10%AP 电极缓冲液：硼酸钠-硼酸（pH8.3） 0.5%溴酚蓝 染色液：0.1%联苯胺 样品提取液：pH8.0Tris-HCl缓冲液 40%蔗糖溶液 四、操作步骤 凝胶制备 聚丙烯酰胺凝胶配方 成分 含量 作用 A液（30%Acr-0.8%Bis） 2.65mL 交联剂 B液（Tris+EDTA） 4.75mL 缓冲液 C液（TEMED） 10μL 加速剂 D液（10% AP） 50μL 催化剂 四、操作步骤 样品制备 称取小麦幼苗叶片0.5 克，放入研钵内，加 pH8.0 样品提取液1mL，于冰浴中研成匀浆，转入离心管，在高速离心机上以 8000rpm 离心 10 分钟，倒出上清液，以等量 40%蔗糖混合，并加2滴溴酚蓝，即为样品液。 四、操作步骤 装槽、上样 30-50μL 四、操作步骤 电泳 接好电源线(上槽接负极，下槽接正极)。打开电源开关，调节电压，以10V/cm稳定电压电泳，待前沿指示染料溴酚蓝下行至距胶板末端1-2 厘米处，即可停止电泳。 四、操作步骤 剥胶、染色 电泳结束之后，