PCR技及其应用.ppt

变性温度与时间： 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因 一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性 若低于93℃则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 退火(复性)温度与时间： 退火温度是影响PCR特异性的重要因素 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作为选择最适退火温度的起点较为理想 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 大肠杆菌体内各聚合酶作用 DNA 聚合酶 Ⅲ 无5’→3外切酶活性切除引物,是复制时的主要聚合酶； DNA 聚合酶 I:主要负责除去引物并利用脱氧核苷酸填满空隙； 1.5’→3’聚合酶活性。2. 5’→3外切酶活性切除引物。3. 3’→5’外切酶活性起校对作用 DNA 聚合酶Ⅱ 有1和3的作用，其他作用尚不清楚。 DNA 聚合酶Ⅳ和Ⅴ 涉及DNA错误修复。 延伸温度与时间： Taq DNA聚合酶的生物学活性： 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 延伸温度与时间： 延伸温度：一般选择在70～75℃之间 常用温度为72℃ 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 3～4kb的靶序列需3～4min 扩增10Kb需延伸至15min 延伸时间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 1.DNA片段长度(核苷酸数)琼脂糖凝胶电泳的核苷酸数与凝胶的范围。 DNA片段长度的检测（0.8%）PCR扩增产物检测（1.5%）。酶切片段检测（2-3.5%）。 2.DNA片段长度(核苷酸数) 丙烯酰胺 1Kb～700bp 3.5 (%) 700b～500b 5 (%) 500b～200b 8 (%) 200b 12(%) PCR反应五要素 引物（primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium） 1、引物 引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增 引物设计的原则 基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。 ①引物长度： 15-30bp，常用20bp左右 — 引物的有效长度不能大于 38 bp，否则最适 延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度 （74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性。 ②引物扩增跨度：以500bp为宜 — 特定条件下可扩增长至10kb的片段 ⑤引物 3’端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰） — 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端 碱基不配对而导致PCR失败 ⑥引物5′端可修饰 — 引物5′端限定着PCR产物的长度，但对扩增特 异性影响不大；引物5′端碱基可不与模板DNA 互补而呈游离状态；引物5′端最多可加10个碱 基而对PCR反应无影响 ⑦引物的特异性： — 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 ⑧引物量： — 每条引物的浓度0.1 ~ 0.5umol或10 ~ 100 pmol以最低引物量产生所需要的结果为好 — 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会 2、酶及其浓度 目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应 天然酶：从水生嗜热杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成 一个典型的 PCR反应约需酶量1- 2.5U/100 ul体系 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过