荧光标记蛋白的发展.pptVIP

荧光标记蛋白的发展;荧光标记蛋白技术实际上是也是一种标记技术。就如同最早用P标记脱氧核糖核酸用S标记蛋白质是一样。;荧光标记蛋白在生物研究反面的作用：荧光标记蛋白的基因可作为报告基因，提供细胞内物质的跟踪定位 ;如左图所示，当体内物质融合了荧光蛋白后会发出荧光，用显微镜、荧光计、荧光激活细胞分选仪等就可以看见，若在靠近体表处且光源强烈则肉眼可视。; ①最早为水母体中提取的GFP②在适当刺激下会改变结构从而发出或改变荧光的第二类荧光蛋白FHP及其典例GPAC ③最新的PRIME技术;GFP;2，GFP发光原理 GFP控制光的部位是其自身的一部分，仅由氨基酸构建而成，该部位含有一段三个氨基酸组成的特殊序列：丝氨酸－酪氨酸－甘氨酸（有时丝氨酸会被相似的苏氨酸取代）。当蛋白质链折叠时，这段短片段就被深埋在蛋白质内部，然后，发生一系列化学反应：甘氨酸与丝氨酸之间形成化学键，生成一个新的闭合环，随后这个环会自动脱水。最终，经过大约一个小时的反应，周围环境中的的氧气攻击酪氨酸的一个化学键，形成一个新的双键并合成荧光发色团。;3，与其他报告基因不同的性质 ①从生化角度来讲, 所有已知的荧光素酶都是氧化酶, 它利用分子氧来氧化底物, 使产物分子处于一种激发态而发光。这种酶/底物的相互作用是生物发光的普遍模式。 而GFP 是第一个例外, 它的27kDa 的单体由238 个氨基酸构成, 本身就是一个生物发光系统。其荧光机制是自身含有的, 绿色荧光的发射仅需分子氧的存在, 而无需其他外源辅因子 ②GFP 的表达无种属特异性。不管细胞的种类和位置如何, 都能够自主表达; ③GFP 还能克服穿透、毒素、光漂白等不利因素[1]。GFP 的荧光可以耐受福尔马林的固定, 因而可以制成长期保存的标本; ④对细胞内GFP 的检测非常简单, 用显微镜、荧光计、荧光激活细胞分选仪等就可实现;FHP（fluorescent highlighter proteins光激活蛋白即第二类荧光蛋白） 及GPAC （Green ＿photoactivatable ＿ Cherry光激活绿樱桃） ;2,GPAC 构成： 这是一个融合蛋白，它融合了红色荧光蛋白（RFP）单体Cherry和GFP的光激活变异体。这种融合蛋白能够在表达标志物的细胞中持续发出红色荧光，而绿色荧光只有在405-nm光激发下才会发出。 特点： ①表达GPAC的细胞在光激活前后都表现出强的红色信号，而绿色荧光只持续数小时。 ②将某一特定蛋白放置在GPAC的N端或C端，均不影响其活性，也不会显著影响胞内蛋白的定位或功能。即便融合伴侣需要大量的翻译后加工和修饰，GPAC仍可容忍。 不足：荧光标签相对较大，超过了50 kDa，这样，与GPAC融合的蛋白在用于功能研究前就必须进行仔细的验证 其杰出性体现在：在时空动力学监测中突出了光转换的部分。;PRIME技术;原理：;优点： ①使用这种方法后，标有荧光探针的肌动蛋白能在细胞中自由游走，并穿过细胞核。 ②此方法能应用于细胞内特定区域的蛋白，比如细胞核、细胞膜或细胞溶质。在连接酶上加入一段信号肽，指导它到达特定区域。之后，酶将荧光探针与此区域的蛋白相连。