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卫生检验基础 第三章紫外可见分光光度法 紫外－可见分光光度法(Ultra violet visible spectrophotometry)是有机化合物结构鉴定的四大光谱(质谱、核磁、红外、紫外－可见)之一，也是仪器分析常用的一种快速、简便的分析方法。它是根据物质的分子对紫外、可见光区辐射的吸收特征对物质结构和组成进行定性或定量的方法。 紫外可见分光光度法 近年来，紫外－可见分光光度法由于采用了先进的光电二极管阵列及计算机技术，使仪器的性能得到极大提高，加上各种应用方法的不断创新与改善，使之达到了前所未有的水平，成为常规质量控制和质量分析不可缺少的方法之一，在工农业、医药卫生、环境保护、生命科学等各领域广泛应用。 第一节 基本原理 一. 紫外－可见吸收光谱 紫外－可见分光光度法属分子吸收光谱法。分子光谱研究的主要内容是分子和电磁辐射的作用。光是一种电磁波，也是一种辐射能，不同波长的光具有不同的能量。 E＝h?＝hc/? 式中h和c都是常数，E代表光的能量，光的波长越短，能量越大；波长越长，能量越小。 第一节 基本原理 物质分子吸收一定光能后，外层电子会从基态跃迁到激发态，发生能级跃迁，产生吸收光谱。分子吸收能量具有量子化特征，它只吸收等于两个能级之差的能量，即?E＝E2－E1＝hv。分子光谱比原子光谱复杂得多，因为分子中除外层价电子吸收辐射能量能产生跃迁外，而且还有组成分子的原子在吸收能量后引起的振动和整个分子的转动运动，因此分子吸收的总能量是三种运动能量之和。 E＝E电＋E振＋E转 第一节 基本原理 三种不同运动涉及三种跃迁能级，它们之间能量差别依次是E电E振E转，所以当物质吸收能量发生电子能级跃迁时，不可避免地会伴随着产生振动能级和转动能级的跃迁，从而导致了分子吸收光谱谱带变宽。 价电子跃迁能级的能量差在1～20ev，相应的光辐射波长为200～760nm，属紫外可见区，其光谱就称为紫外可见吸收光谱。 二. 紫外－可见吸收光谱与分子结构的关系 1. 有机化合物的吸收光谱 紫外－可见吸收光谱由分子的价电子跃迁决定。分子组成不同，产生的吸收光谱也不同。分子吸收能量后，外层价电子将从成键轨道跃迁至能量较高的反键轨道中，在紫外、可见区域常见的跃迁包括????，n???, n???, ????四种，各种电子由基态跃迁到激发态时所需能量不同，它们所需的能量依次如下： ???? n??? ? ???? n??? n???和????跃迁是用紫外、可见分光光度法研究有机物的最常见的跃迁类型。这类跃迁易发生，所需能量使吸收波长都处在200nm以上区域，所涉及的基团都具有不饱和的?键，这种含不饱和?键的基团称为生色团。 某一特定波长的吸收峰通常表明存在某个生色团，但因受分子环境及溶解样品溶剂的影响，其最大吸收峰位置并不固定；另外，pH、温度等因素同样会影响吸收峰的强度和位置。对有机物吸收的影响因素主要有： (1) 共轭双键的数目 具有共轭双键体系、结构相似的一系列有机化合物, 随着共轭双键的增加,化合物的最大吸收显著红移, 吸收强度增大, 颜色加深。对芳香化合物, 随着共轭体系的增大, 最大吸收显著红移, 颜色加深。 (2) 助色团 共轭体系的有机化合物分子中, 引入吸电子或给电子助色团, 最大吸收向长波方向移动, 颜色加深; 在共轭体系的两端或苯环的对位同时引入两种不同性质的助色团, 其助色作用更为显著。 (3) 分子离子化 含有吸电子或给电子助色团的有机化合物分子具有离子化的特性, 这种离子化作用导致吸电子基的吸电子能力或给电子基的推电子能力加强, 共轭体系的?电子云发生偏移极化, ????跃迁的能级差缩小, 最大吸收峰红移, 颜色加深。 (4) 溶剂的性质 溶剂的极性对????和n???跃迁吸收带的影响不同。由于极性溶剂可与溶质形成氢键, 或使溶质的极性增加, 对????跃迁, 激发态极性比基态的强, 极性溶剂使激发态的极性增强, 降低了激发态的能量, 使产生跃迁的能量差减小, 最大吸收波长红移; 对n???, 未成键的电子对在基态时与极性溶剂形成氢键, 降低了基态的能量, 使产生跃迁的能量差增大, 最大吸收波长紫移。 (5) 空间位阻效应 共轭分子中, 各原子都处在同一平面内, 能产生最好的共轭作用, 当共轭分子的平面结构因空间位阻或其它因素的影响而受到破坏时, 共轭体系被分割, ?电子云重叠程度减弱, 在共轭体系中?电子的流动性受到某种程度的阻碍, 最大吸收向短波方向移动, 颜色变浅。 2. 金属配合物的电子吸收光谱